Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Summary

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l’esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Abstract

La respirazione mitocondriale è una via critica che genera energia in tutte le cellule, in particolare i fotorecettori della retina che possiedono un metabolismo altamente attivo. Inoltre, i fotorecettori mostrano anche un’elevata glicolisi aerobica come le cellule tumorali. Misurazioni precise di queste attività metaboliche possono fornire preziose informazioni sull’omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche e negli stati patologici. Sono stati sviluppati saggi basati su micropiastre ad alto rendimento per misurare la respirazione mitocondriale e varie attività metaboliche nelle cellule vive. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono sviluppati per cellule in coltura e non sono stati ottimizzati per campioni di tessuto intatto e per l’applicazione ex vivo. Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo, che utilizza la tecnologia di fluorescenza basata su micropiastre, per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale, nonché il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) come indicatore di glicolisi, nel tessuto retinico ex vivo intatto. Questo metodo è stato utilizzato per valutare con successo le attività metaboliche nella retina del topo adulto e dimostrare la sua applicazione nello studio dei meccanismi cellulari dell’invecchiamento e della malattia.

Introduction

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l’omeostasi e l’apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici ^cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell’ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glicolisi nel citosol, dove il glucosio viene convertito in piruvato, che può essere ulteriormente convertito in lattato o trasportato nei mitocondri e ossidato in acetil-CoA, un substrato nel ciclo dell’acido tricarbossilico (ciclo TCA).

La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi nei ^mammiferi2, che mostra alti livelli di respirazione mitocondriale e un consumo di ossigeno estremamente ^elevato3. I fotorecettori a bastoncello e cono contengono un’alta densità di mitocondri4 e OXPHOS genera la maggior parte dell’ATP nella ^retina5. Inoltre, la retina si basa fortemente sulla glicolisi ^aerobica6,7 convertendo il glucosio in ^lattato5. I difetti mitocondriali sono associati a varie malattie neurodegenerative8,9; e con le sue elevate richieste energetiche uniche, la retina è particolarmente vulnerabile ai difetti metabolici, compresi quelli che colpiscono OXPHOS4 mitocondriale e glicolisi10. La disfunzione mitocondriale e i difetti della glicolisi sono implicati nelle malattie degenerative della ^retina11,12 e macular13, nella degenerazione maculare legata all’età10,14,15,16 e nella retinopatia ^{diabetica17,18}. Pertanto, misurazioni accurate della respirazione mitocondriale e della glicolisi possono fornire parametri importanti per valutare l’integrità e la salute della retina.

La respirazione mitocondriale può essere misurata attraverso la determinazione del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Dato che la conversione del glucosio in piruvato e successivamente in lattato provoca l’estrusione di protoni e l’acidificazione dell’ambiente extracellulare, le misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) forniscono un’indicazione del flusso di glicolisi. Poiché la retina è composta da più tipi di cellule con relazioni intime e sinergia attiva, incluso lo scambio di ^substrati6, è imperativo analizzare la funzione mitocondriale e il metabolismo nel contesto dell’intero tessuto retinico con laminazione e circuiti intatti. Negli ultimi decenni, gli elettrodi _O2 di tipo Clark e altri microelettrodi di ossigeno sono stati utilizzati per misurare il consumo di ossigeno nella retina19,20,21. Questi elettrodi di ossigeno hanno importanti limitazioni nella sensibilità, nella necessità di un grande volume di campione e nella necessità di un’agitazione continua del campione sospeso, che di solito porta alla rottura del contesto cellulare e tissutale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato utilizzando una tecnica di fluorescenza basata su micropiastre per misurare il metabolismo energetico mitocondriale nel tessuto retinico di topo ex vivo appena sezionato. Consente misurazioni in tempo reale a medio rendimento di OCR ed ECAR contemporaneamente utilizzando un piccolo campione (punzone da 1 mm) di tessuto retinico ex vivo, evitando la necessità di sospensione e agitazione continua.

Qui è dimostrata la procedura sperimentale per il test dello stress mitocondriale e il test della velocità glicolitica su dischi di punzonatura retinica appena sezionati. Questo protocollo consente la misurazione delle attività metaboliche correlate ai mitocondri in un contesto tissutale ex vivo. A differenza dei saggi eseguiti utilizzando cellule in coltura, le letture qui ottenute riflettono il metabolismo energetico combinato a livello tissutale e sono influenzate dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule all’interno del tessuto. Il protocollo è stato modificato da una versione precedentemente ^{pubblicata22,23} per adattarsi alla nuova generazione dell’analizzatore a flusso extracellulare a 24 pozzetti Agilent Seahorse (XFe24) con piastra Islet Capture. Anche il mezzo di dosaggio, le concentrazioni del composto di iniezione e il numero/durata dei cicli di analisi sono stati ottimizzati per il tessuto retinico. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la preparazione dei dischi di punzonatura retinica. Ulteriori informazioni sulla configurazione del programma e sull’analisi dei dati possono essere ottenute dalla guida per l’utente del ^{produttore24,25,26}.

Protocol

Tutti i protocolli del topo sono stati approvati dall’Animal Care and Use Committee del National Eye Institute (NEI ASP# 650). I topi sono stati alloggiati in condizioni di luce-buio di 12 ore e curati seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio, l’Istituto delle risorse animali da laboratorio e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Cartuccia del sensore idratante e preparazione del mezzo…

Representative Results

I dati riportati qui sono un test rappresentativo dello stress mitocondriale che mostra tracce OCR (Figura 1) e test della velocità glicolitica che mostra traccia OCR e traccia ECAR (Figura 2), che sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da 1 mm appena sezionati da topi transgenici Nrl-L-EGFP di 4 mesi ( sfondo C57B / L6). Questi topi esprimono GFP specificamente nei fotorecettori a bastoncello senza alterare i…

Discussion

Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate per l’esecuzione di saggi basati su micropiastre della respirazione mitocondriale e dell’attività di glicolisi utilizzando dischi di perforazione retinica ex vivo appena sezionati. Il protocollo è stato ottimizzato per: 1) garantire l’utilizzo di un mezzo di saggio idoneo per il tessuto retinico ex vivo; 2) impiegare dischi di punzonatura retinica di dimensioni adeguate per ottenere letture OCR ed ECAR che rientrano nel campo di rilevamento ottimale della…

Materials

1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113