Определение митохондриального дыхания и гликолиза в образцах ткани сетчатки ex vivo

Summary

Здесь описан подробный протокол для проведения анализа митохондриального стресса и анализа скорости гликолитизма в образцах ткани сетчатки ex vivo с использованием коммерческого биоанализатора.

Abstract

Митохондриальное дыхание является критическим энергетическим путем во всех клетках, особенно в фоторецепторах сетчатки, которые обладают высокоактивным метаболизмом. Кроме того, фоторецепторы также демонстрируют высокий аэробный гликолиз, как раковые клетки. Точные измерения этих метаболических активностей могут дать ценную информацию о клеточном гомеостазе в физиологических условиях и в болезненных состояниях. Высокопроизводительные микропластинчатые анализы были разработаны для измерения митохондриального дыхания и различных метаболических активностей в живых клетках. Тем не менее, подавляющее большинство из них разработаны для культивируемых клеток и не были оптимизированы для интактных образцов тканей и для применения ex vivo. Здесь описан подробный пошаговый протокол, использующий технологию флуоресценции на основе микропластин, для непосредственного измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания, а также скорости внеклеточного подкисления (ECAR) в качестве индикатора гликолиза в неповрежденной ex vivo ткани сетчатки. Этот метод был использован для успешной оценки метаболической активности в сетчатке взрослой мыши и демонстрации его применения в исследовании клеточных механизмов старения и заболеваний.

Introduction

Митохондрии являются важными органеллами, которые регулируют клеточный метаболизм, передачу сигналов, гомеостаз и апоптоз, координируя несколько важных физиологических ^{процессов1}. Митохондрии служат электростанцией в клетке для генерации аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и обеспечивают энергию, которая поддерживает почти все клеточные события. Большая часть клеточного кислорода метаболизируется в митохондриях, где он служит конечным акцептором электронов в цепи переноса электронов (ETC) во время аэробного дыхания. Низкие количества АТФ также могут быть получены в результате гликолиза в цитозоле, где глюкоза превращается в пируват, который может быть дополнительно преобразован в лактат или транспортироваться в митохондрии и окисляться до ацетил-КоА, субстрата в цикле трикарбоновой кислоты (цикл ТЦА).

Сетчатка является одной из наиболее метаболически активных тканей у ^{млекопитающих2}, демонстрируя высокий уровень митохондриального дыхания и чрезвычайно высокое потребление ^{кислорода3}. Палочковые и конусные фоторецепторы содержат высокую плотность митохондрий4, а OXPHOS генерирует большую часть АТФ в сетчатке5. Кроме того, сетчатка также в значительной степени зависит от аэробного гликолиза6,7 путем преобразования глюкозы в лактат5. Митохондриальные дефекты связаны с различными нейродегенеративными ^{заболеваниями8,9}; и с его уникальными высокими энергетическими потребностями, сетчатка особенно уязвима к метаболическим дефектам, в том числе тем, которые влияют на митохондриальный OXPHOS4 и гликолиз10. Митохондриальная дисфункция и дефекты гликолиза связаны с дегенеративными заболеваниями ^{сетчатки11,12} и макулярной13, возрастной макулярной дегенерацией10,14,15,16 и диабетической ретинопатией17,18. Поэтому точные измерения митохондриального дыхания и гликолиза могут обеспечить важные параметры для оценки целостности и здоровья сетчатки.

Митохондриальное дыхание может быть измерено путем определения скорости потребления кислорода (OCR). Учитывая, что превращение глюкозы в пируват, а затем в лактат приводит к экструзии протонов и подкислению внеклеточной среды, измерения скорости внеклеточного подкисления (ECAR) дают представление о потоке гликолиза. Поскольку сетчатка состоит из нескольких типов клеток с близкими отношениями и активной синергией, включая обмен ^{субстратами6}, крайне важно проанализировать митохондриальную функцию и метаболизм в контексте всей ткани сетчатки с неповрежденным ламинированием и схемой. В течение последних нескольких десятилетий электроды Кларка типа _O2 и другие кислородные микроэлектроды использовались для измерения потребления кислорода в сетчатке19,20,21. Эти кислородные электроды имеют серьезные ограничения в чувствительности, требовании большого объема образца и необходимости непрерывного перемешивания суспендирующего образца, что обычно приводит к нарушению клеточного и тканевого контекста. Протокол, описанный здесь, был разработан с использованием флуоресцентного метода на основе микропластин для измерения митохондриального энергетического метаболизма в свежерассеченной ткани сетчатки мыши ex vivo. Он позволяет одновременно измерять OCR и ECAR со средней пропускной способностью в режиме реального времени с использованием небольшого образца (1 мм перфоратора) ткани сетчатки ex vivo, избегая при этом необходимости в суспензии и непрерывном перемешивании.

Здесь показана экспериментальная процедура анализа митохондриального стресса и анализа гликолитической скорости на свежерассеченных перфораторных дисках сетчатки. Этот протокол позволяет измерять метаболическую активность, связанную с митохондриями, в контексте ткани ex vivo. В отличие от анализов, выполняемых с использованием культивируемых клеток, показания, полученные здесь, отражают комбинированный энергетический метаболизм на тканевом уровне и зависят от взаимодействия между различными типами клеток в ткани. Протокол модифицирован по сравнению с ранее опубликованной версией ^22,23 для адаптации к новому поколению внеклеточного анализатора 24-луночного потока Agilent Seahorse (XFe24) с пластиной Islet Capture. Среда для анализа, концентрации инъекционных соединений и количество/продолжительность циклов анализа также были оптимизированы для ткани сетчатки. Приведен подробный пошаговый протокол приготовления перфораторных дисков сетчатки. Более подробную информацию о настройке программы и анализе данных можно получить из руководства пользователя производителя24,25,26.

Protocol

Все мышиные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института глаз (NEI ASP# 650). Мыши содержались в 12-часовых светло-темных условиях и ухаживали за ними, следуя рекомендациям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, Инст?…

Representative Results

Данные, представленные здесь, представляют собой репрезентативный анализ митохондриального стресса, показывающий след OCR (рисунок 1), и анализ гликолитической скорости, показывающий след OCR и след ECAR (рисунок 2), которые были выполнены с использованием не?…

Discussion

Здесь приведены подробные инструкции по проведению микропластинчатых анализов активности митохондриального дыхания и гликолиза с использованием ex vivo, свежерассеченных перфораторных дисков сетчатки. Протокол был оптимизирован для: 1) обеспечения использования подходящей среды …

Materials

1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113