Étude spectrométrique de masse à multiples facettes des neuropeptides chez Callinectes sapidus
Summary
La caractérisation par spectrométrie de masse des neuropeptides fournit des informations de séquence, de quantification et de localisation. Ce flux de travail optimisé est non seulement utile pour les études de neuropeptides, mais aussi pour d’autres peptides endogènes. Les protocoles fournis ici décrivent la préparation des échantillons, l’acquisition de la SEP, l’analyse de la SEP et la génération de bases de données de neuropeptides à l’aide de l’imagerie LC-ESI-MS, MALDI-MS et MALDI-MS.
Abstract
Les neuropeptides sont des molécules de signalisation qui régulent presque tous les processus physiologiques et comportementaux, tels que le développement, la reproduction, l’apport alimentaire et la réponse aux facteurs de stress externes. Pourtant, les mécanismes biochimiques et l’ensemble des neuropeptides et leurs rôles fonctionnels restent mal compris. La caractérisation de ces peptides endogènes est entravée par l’immense diversité au sein de cette classe de molécules de signalisation. De plus, les neuropeptides sont bioactifs à des concentrations 100x – 1000x inférieures à celles des neurotransmetteurs et sont sujets à la dégradation enzymatique après libération synaptique. La spectrométrie de masse (SEP) est un outil analytique très sensible qui permet d’identifier, de quantifier et de localiser les analytes sans connaissances a priori approfondies. Il est bien adapté pour profiler globalement les neuropeptides et aider à la découverte de nouveaux peptides. En raison de la faible abondance et de la grande diversité chimique de cette classe de peptides, plusieurs méthodes de préparation d’échantillons, paramètres d’acquisition de SEP et stratégies d’analyse de données ont été adaptés à partir de techniques protéomiques pour permettre une caractérisation optimale des neuropeptides. Ici, des méthodes sont décrites pour isoler les neuropeptides de tissus biologiques complexes pour la caractérisation, la quantification et la localisation de séquences à l’aide de la chromatographie liquide (LC)-MS et de la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)-MS. Un protocole pour la préparation d’une base de données de neuropeptides à partir du crabe bleu, Callinectes sapidus, un organisme sans informations génomiques complètes, est inclus. Ces flux de travail peuvent être adaptés pour étudier d’autres classes de peptides endogènes chez différentes espèces à l’aide d’une variété d’instruments.
Introduction
Le système nerveux est complexe et nécessite un réseau de neurones pour transmettre des signaux dans tout un organisme. Le système nerveux coordonne l’information sensorielle et la réponse biologique. Les interactions complexes et alambiquées impliquées dans la transmission du signal nécessitent de nombreuses molécules de signalisation différentes telles que les neurotransmetteurs, les stéroïdes et les neuropeptides. Comme les neuropeptides sont les molécules de signalisation les plus diverses et les plus puissantes qui jouent un rôle clé dans l’activation des réponses physiologiques au stress et à d’autres stimuli, il est intéressant de déterminer leur rôle spécifique dans ces processus physiologiques. La fonction des neuropeptides est liée à leur structure en acides aminés, qui détermine la mobilité, l’interaction des récepteurs et l’affinité1. Des techniques telles que l’histochimie, qui est importante parce que les neuropeptides peuvent être synthétisés, stockés et libérés dans différentes régions du tissu, et l’électrophysiologie ont été utilisées pour étudier la structure et la fonctiondes neuropeptides 2,3,4, mais ces méthodes sont limitées par le débit et la spécificité pour résoudre la grande diversité de séquences des neuropeptides.
La spectrométrie de masse (SEP) permet l’analyse à haut débit de la structure et de l’abondance des neuropeptides. Cela peut être effectué par différentes techniques MS, le plus souvent la chromatographie liquide-ionisation par électropulvérisation MS (LC-ESI-MS)5 et la désorption/ionisation laser assistée par matrice MS (MALDI-MS)6. En utilisant des mesures de masse de haute précision et la fragmentation de la SEP, la SEP offre la possibilité d’attribuer la séquence d’acides aminés et le statut de modification post-traductionnelle (PTM) aux neuropeptides de mélanges complexes sans connaissance a priori pour aider à déterminer leur fonction 7,8. En plus de l’information qualitative, la SEP permet l’information quantitative des neuropeptides grâce à la quantification sans étiquette (LFQ) ou à des méthodes basées sur l’étiquette telles que le marquage isotopique ou isobare9. Les principaux avantages de LFQ comprennent sa simplicité, son faible coût d’analyse et la diminution des étapes de préparation des échantillons, ce qui peut minimiser la perte d’échantillons. Cependant, les inconvénients de LFQ comprennent l’augmentation des coûts de temps d’instrument, car il nécessite plusieurs répétitions techniques pour traiter les erreurs quantitatives de la variabilité d’une exécution à l’autre. Cela conduit également à une diminution de la capacité à quantifier avec précision les petites variations. Les méthodes basées sur l’étiquette sont soumises à des variations moins systématiques, car plusieurs échantillons peuvent être marqués différemment à l’aide d’une variété d’isotopes stables, combinés en un seul échantillon et analysés simultanément par spectrométrie de masse. Cela augmente également le débit, bien que les étiquettes isotopiques puissent prendre beaucoup de temps et être coûteuses à synthétiser ou à acheter. La complexité spectrale des spectres de masse à balayage complet (MS1) augmente également à mesure que le multiplexage augmente, ce qui diminue le nombre de neuropeptides uniques pouvant être fragmentés et donc identifiés. Inversement, le marquage isobare n’augmente pas la complexité spectrale au niveau MS1, bien qu’il présente des défis pour les analytes de faible abondance tels que les neuropeptides. Comme la quantification isobare est effectuée au niveau des spectres de masse d’ions fragmentaires (MS2), les neuropeptides de faible abondance peuvent ne pas être en mesure d’être quantifiés car des composants de matrice plus abondants peuvent être sélectionnés pour la fragmentation et ceux sélectionnés peuvent ne pas avoir une abondance suffisamment élevée pour être quantifiés. Avec le marquage isotopique, la quantification peut être effectuée sur chaque peptide identifié.
En plus de l’identification et de la quantification, les informations de localisation peuvent être obtenues par MS par le biais de l’imagerie MALDI-MS (MALDI-MSI)10. En raster un laser sur une surface d’échantillon, les spectres MS peuvent être compilés dans une image de carte thermique pour chaque valeur m/z . La cartographie de l’intensité du signal neuroptidique transitoire dans différentes régions à travers les conditions peut fournir des informations précieuses pour la détermination de la fonction11. La localisation des neuropeptides est particulièrement importante car la fonction des neuropeptides peut différer selon l’emplacement12.
Les neuropeptides se trouvent en plus faible abondance in vivo que d’autres molécules de signalisation, telles que les neurotransmetteurs, et nécessitent donc des méthodes sensibles pour la détection13. Cela peut être réalisé par l’élimination des composants de la matrice d’abondance plus élevée, tels que les lipides11,14. Des considérations supplémentaires pour l’analyse des neuropeptides doivent être prises en compte par rapport aux flux de travail protéomiques courants, principalement parce que la plupart des analyses neuropeptidomiques omettent la digestion enzymatique. Cela limite les options logicielles pour l’analyse des données sur les neuropeptides, car la plupart ont été construites avec des algorithmes basés sur des données protéomiques et des correspondances de protéines informées par la détection de peptides. Cependant, de nombreux logiciels tels que PEAKS15 sont plus adaptés à l’analyse des neuropeptides en raison de leurs capacités de séquençage de novo. Plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour l’analyse des neuropeptides, de la méthode d’extraction à l’analyse des données sur la SEP.
Les protocoles décrits ici comprennent des méthodes de préparation d’échantillons et de marquage isotopique diméthylique, d’acquisition de données et d’analyse de données de neuropeptides par LC-ESI-MS, MALDI-MS et MALDI-MSI. Grâce aux résultats représentatifs de plusieurs expériences, l’utilité et la capacité de ces méthodes à identifier, quantifier et localiser les neuropeptides des crabes bleus, Callinectes sapidus, sont démontrées. Pour mieux comprendre le système nerveux, des systèmes modèles sont couramment utilisés. De nombreux organismes n’ont pas de génome entièrement séquencé disponible, ce qui empêche la découverte complète de neuropeptides au niveau peptidique. Afin d’atténuer ce défi, un protocole d’identification de nouveaux neuropeptides et d’extraction de transcriptomes afin de générer des bases de données pour les organismes sans informations complètes sur le génome est inclus. Tous les protocoles présentés ici peuvent être optimisés pour des échantillons de neuropeptides de n’importe quelle espèce, ainsi que pour l’analyse de tous les peptides endogènes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’identification, la quantification et la localisation précises des neuropeptides et des peptides endogènes présents dans le système nerveux sont cruciales pour comprendre leur fonction23,24. La spectrométrie de masse est une technique puissante qui peut permettre d’accomplir tout cela, même dans des organismes sans génome entièrement séquencé. La capacité de ce protocole à détecter, quantifier et localiser les neuropeptides des tissus prélevés…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation (CHE-1710140 et CHE-2108223) et les National Institutes of Health (NIH) grâce à la subvention R01DK071801. A.P. a été soutenu en partie par la subvention de formation à l’interface chimie-biologie des NIH (T32 GM008505). N.V.Q. a été soutenu en partie par les National Institutes of Health, dans le cadre du Ruth L. Kirschstein National Research Service Award du National Heart Lung and Blood Institute au Centre de recherche cardiovasculaire de l’Université du Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. tient à remercier les subventions R56 MH110215, S10RR029531 et S10OD025084 des NIH, ainsi que le soutien financier d’une chaire Vilas Distinguished Achievement et d’une chaire Charles Melbourne Johnson avec un financement fourni par la Wisconsin Alumni Research Foundation et l’Université du Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
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