Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사
Summary
뉴로펩타이드의 질량 분광학적 특성화는 서열, 정량 및 국소화 정보를 제공한다. 이 최적화 된 워크 플로는 신경 펩티드 연구뿐만 아니라 다른 내인성 펩타이드에도 유용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 스포팅 및 MALDI-MS 이미징을 사용하는 뉴로펩타이드의 샘플 준비, MS 획득, MS 분석 및 데이터베이스 생성을 기술한다.
Abstract
뉴로펩타이드는 발달, 번식, 음식 섭취, 외부 스트레스 요인에 대한 반응과 같은 거의 모든 생리적 및 행동 과정을 조절하는 신호 전달 분자입니다. 그러나 생화학 적 메커니즘과 신경 펩티드의 완전한 보완 및 그 기능적 역할은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이들 내인성 펩티드의 특성화는 신호전달 분자의 이러한 부류 내의 엄청난 다양성에 의해 방해된다. 또한, 뉴로펩타이드는 신경전달물질보다 100x – 1000배 낮은 농도에서 생리활성이며 시냅스 방출 후 효소적 분해가 발생하기 쉽다. 질량 분광법 (MS)은 포괄적 인 선험적 지식없이 분석물을 식별, 정량화 및 현지화 할 수있는 매우 민감한 분석 도구입니다. 전 세계적으로 뉴로펩타이드를 프로파일링하고 새로운 펩타이드의 발견을 돕는 데 매우 적합합니다. 이러한 부류의 펩티드의 낮은 풍부도와 높은 화학적 다양성으로 인해, 몇몇 샘플 준비 방법, MS 획득 파라미터 및 데이터 분석 전략은 최적의 뉴로펩타이드 특성화를 허용하기 위해 프로테오믹스 기술로부터 적응되었다. 여기에서는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)-MS를 사용하여 서열 특성화, 정량 및 국소화를 위해 복잡한 생물학적 조직으로부터 신경 펩티드를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 블루 크랩으로부터 뉴로펩타이드 데이터베이스를 제조하기 위한 프로토콜로, 포괄적인 게놈 정보가 없는 유기체인 Callinectes sapidus가 포함된다. 이러한 워크플로우는 다양한 장비를 사용하여 다른 종의 내인성 펩타이드의 다른 클래스를 연구하도록 조정할 수 있습니다.
Introduction
신경계는 복잡하며 유기체 전체에 신호를 전달하기 위해 뉴런 네트워크가 필요합니다. 신경계는 감각 정보와 생물학적 반응을 조정합니다. 신호 전달과 관련된 복잡하고 복잡한 상호 작용에는 신경 전달 물질, 스테로이드 및 신경 펩티드와 같은 많은 다른 신호 분자가 필요합니다. 뉴로펩타이드는 스트레스 및 기타 자극에 대한 생리적 반응을 활성화시키는 데 중요한 역할을 하는 가장 다양하고 강력한 신호전달 분자이기 때문에, 이러한 생리적 과정에서 이들의 특정 역할을 결정하는 것이 관심의 대상이다. 뉴로펩타이드 기능은 이동성, 수용체 상호작용 및 친화도를 결정하는 아미노산 구조와 관련이 있다1. 신경 펩티드가 조직의 다른 영역에서 합성, 저장 및 방출 될 수 있기 때문에 중요한 조직 화학과 같은 기술 및 전기 생리학은 신경 펩티드 구조 및 기능 2,3,4를 조사하기 위해 사용되었지만 이러한 방법은 신경 펩티드의 광대 한 서열 다양성을 해결하기위한 처리량 및 특이성에 의해 제한됩니다.
질량 분광법 (MS)은 신경 펩티드 구조 및 풍부도의 높은 처리량 분석을 가능하게합니다. 이것은 상이한 MS 기술, 가장 일반적으로 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화 MS (LC-ESI-MS)5 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 MS (MALDI-MS)6를 통해 수행될 수 있다. 고정밀 질량 측정 및 MS 단편화를 활용하여, MS는 그들의 기능 7,8을 확인하는 것을 돕기 위해 선험적 지식 없이 복잡한 혼합물로부터 뉴로펩티드에 아미노산 서열 및 번역 후 변형(PTM) 상태를 할당하는 능력을 제공한다. 정성적 정보 이외에, MS는 무표지 정량(LFQ) 또는 동위원소 또는 등압 표지9와 같은 표지 기반 방법을 통해 신경펩티드의 정량적 정보를 가능하게 한다. LFQ의 주요 장점은 단순성, 낮은 분석 비용 및 샘플 손실을 최소화 할 수있는 샘플 준비 단계 감소입니다. 그러나 LFQ의 단점은 실행 간 변동성으로 인한 정량적 오류를 해결하기 위해 여러 기술 반복실험이 필요하기 때문에 계측기 시간 비용이 증가한다는 것입니다. 이것은 또한 작은 변화를 정확하게 정량화하는 능력을 감소시킵니다. 라벨 기반 방법은 여러 샘플이 다양한 안정한 동위원소를 사용하여 차등적으로 표지되고, 하나의 샘플로 결합되고, 질량 분광법을 통해 동시에 분석 될 수 있기 때문에 덜 체계적인 변형을 겪습니다. 이것은 또한 처리량을 증가시키지만, 동위원소 라벨은 합성하거나 구매하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 전체 스캔 질량 스펙트럼(MS1) 스펙트럼 복잡성 또한 멀티플렉싱이 증가함에 따라 증가하며, 이는 단편화될 수 있는 독특한 뉴로펩티드의 수를 감소시키고, 따라서 식별된다. 반대로, 등압 표지는 MS1 수준에서 스펙트럼 복잡성을 증가시키지 않지만, 뉴로펩타이드와 같은 낮은 풍부 분석물에 대한 도전을 도입한다. 등압 정량이 단편 이온 질량 스펙트럼(MS2) 수준에서 수행됨에 따라, 저풍부 뉴로펩티드는 단편화를 위해 더 풍부한 매트릭스 성분이 선택될 수 있고 선택된 것들은 정량화되기에 충분한 풍부도를 갖지 않을 수 있기 때문에 정량화될 수 없을 수 있다. 동위원소 표지를 사용하면 확인된 모든 펩티드에 대해 정량을 수행할 수 있습니다.
식별 및 정량화 이외에도, 국소화 정보는 MALDI-MS 이미징(MALDI-MSI)10을 통해 MS에 의해 획득될 수 있다. 샘플 표면을 가로질러 레이저를 래스터링함으로써, MS 스펙트럼은 각 m/z 값에 대한 히트 맵 이미지로 컴파일될 수 있다. 조건에 걸쳐 상이한 영역에서의 일시적 뉴로펩타이드 신호 세기를 매핑하는 것은 기능 결정(11)에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 뉴로펩티드의 국소화는 뉴로펩티드 기능이 위치12에 따라 다를 수 있기 때문에 특히 중요하다.
뉴로펩티드는 신경전달물질과 같은 다른 신호전달 분자들보다 낮은 풍부도의 생체내에서 발견되며, 따라서 검출을 위한 민감한 방법들(13)을 필요로 한다. 이는 지질11,14와 같은 더 높은 풍부 매트릭스 성분의 제거를 통해 달성될 수 있다. 신경 펩티드의 분석을위한 추가적인 고려 사항은 일반적인 프로테오믹스 워크 플로우와 비교할 때 이루어져야하며, 주로 대부분의 neuropeptidomic 분석이 효소 소화를 생략하기 때문입니다. 이것은 뉴로펩타이드 데이터 분석을 위한 소프트웨어 옵션을 제한하는데, 이는 대부분 프로테오믹스 데이터와 펩티드 검출에 의해 정보화된 단백질 일치를 기반으로 하는 알고리즘으로 구축되었기 때문이다. 그러나, PEAKS15와 같은 많은 소프트웨어는 그들의 de novo 시퀀싱 능력으로 인해 뉴로펩타이드 분석에 더 적합하다. 추출 방법에서 MS 데이터 분석에 이르기까지 신경 펩티드의 분석을 위해 몇 가지 요인을 고려해야합니다.
여기에 기술된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 및 MALDI-MSI에 의한 뉴로펩티드의 샘플 제조 및 디메틸 동위원소 표지, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 방법을 포함한다. 여러 실험의 대표적인 결과를 통해 푸른 게, Callinectes sapidus에서 신경 펩티드를 식별, 정량화 및 국소화하는 이러한 방법의 유용성과 능력이 입증됩니다. 신경계를 더 잘 이해하기 위해 모델 시스템이 일반적으로 사용됩니다. 많은 유기체는 완전히 서열화된 게놈을 이용할 수 없으며, 이는 펩티드 수준에서 포괄적인 뉴로펩티드 발견을 방지한다. 이러한 도전을 완화하기 위해, 완전한 게놈 정보 없이 유기체에 대한 데이터베이스를 생성하기 위해 신규한 뉴로펩티드 및 전사체 마이닝을 확인하기 위한 프로토콜이 포함된다. 여기에 제시된 모든 프로토콜은 모든 종의 뉴로펩타이드 샘플에 최적화될 수 있을 뿐만 아니라 임의의 내인성 펩티드의 분석에도 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경계에서 발견되는 신경 펩티드 및 내인성 펩티드의 정확한 식별, 정량화 및 국소화는 그들의 기능을 이해하는 데 결정적이다23,24. 질량 분광법은 완전히 서열화 된 게놈이없는 유기체에서조차도이 모든 것을 달성 할 수있는 강력한 기술입니다. LC-ESI- 및 MALDI-MS의 조합을 통해 C. sapidus로부터 수집된 조직으로부터 신경펩티드를 검출, 정량화 및 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 R01DK071801 보조금을 통해 국립 과학 재단 (CHE-1710140 및 CHE-2108223)과 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. A.P.는 NIH 화학-생물학 인터페이스 교육 보조금(T32 GM008505)에 의해 부분적으로 지원되었다. N.V.Q.는 국립 심장 폐 및 혈액 연구소에서 위스콘신-매디슨 심혈관 연구 센터 (T32 HL007936)에 이르기까지 루스 L. 키르슈타인 국립 연구 서비스 상 (Ruth L. Kirschstein National Research Service Award)에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지원을 받았다. L.L.은 NIH 보조금 R56 MH110215, S10RR029531 및 S10OD025084뿐만 아니라 위스콘신 동문 연구 재단 및 위스콘신 – 매디슨 약학부에서 제공하는 자금으로 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson 교수직의 자금 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
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