Многогранное масс-спектрометрическое исследование нейропептидов в Callinectes sapidus
Summary
Масс-спектрометрическая характеристика нейропептидов обеспечивает информацию о последовательности, количестве и локализации. Этот оптимизированный рабочий процесс полезен не только для исследований нейропептидов, но и других эндогенных пептидов. Представленные здесь протоколы описывают подготовку образцов, сбор РС, анализ РС и генерацию базы данных нейропептидов с использованием LC-ESI-MS, MALDI-MS и визуализации MALDI-MS.
Abstract
Нейропептиды являются сигнальными молекулами, которые регулируют почти все физиологические и поведенческие процессы, такие как развитие, размножение, потребление пищи и реакция на внешние стрессоры. Тем не менее, биохимические механизмы и полный набор нейропептидов и их функциональные роли остаются плохо изученными. Характеристика этих эндогенных пептидов затруднена огромным разнообразием в этом классе сигнальных молекул. Кроме того, нейропептиды биологически активны в концентрациях 100x – 1000x ниже, чем у нейротрансмиттеров, и склонны к ферментативной деградации после синаптического высвобождения. Масс-спектрометрия (MS) является высокочувствительным аналитическим инструментом, который может идентифицировать, количественно оценивать и локализовать аналиты без всесторонних априорных знаний . Он хорошо подходит для глобального профилирования нейропептидов и помогает в открытии новых пептидов. Из-за низкой численности и высокого химического разнообразия этого класса пептидов несколько методов пробоподготовки, параметров получения РС и стратегий анализа данных были адаптированы из методов протеомики, чтобы обеспечить оптимальную характеристику нейропептидов. Здесь описаны способы выделения нейропептидов из сложных биологических тканей для характеризации последовательностей, квантования и локализации с использованием жидкостной хроматографии (LC)-MS и матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI)-MS. Включен протокол подготовки базы данных нейропептидов синего краба Callinectes sapidus, организма без исчерпывающей геномной информации. Эти рабочие процессы могут быть адаптированы для изучения других классов эндогенных пептидов у разных видов с использованием различных инструментов.
Introduction
Нервная система сложна и требует сети нейронов для передачи сигналов по всему организму. Нервная система координирует сенсорную информацию и биологическую реакцию. Сложные и запутанные взаимодействия, участвующие в передаче сигнала, требуют множества различных сигнальных молекул, таких как нейротрансмиттеры, стероиды и нейропептиды. Поскольку нейропептиды являются наиболее разнообразными и мощными сигнальными молекулами, которые играют ключевую роль в активации физиологических реакций на стресс и другие раздражители, интересно определить их конкретную роль в этих физиологических процессах. Нейропептидная функция связана с их аминокислотной структурой, которая определяет подвижность, рецепторное взаимодействие и сродство1. Такие методы, как гистохимия, которая важна, потому что нейропептиды могут синтезироваться, храниться и высвобождаться в разных областях ткани, и электрофизиология были использованы для исследования структуры и функции нейропептидов 2,3,4, но эти методы ограничены пропускной способностью и специфичностью для разрешения огромного разнообразия последовательностей нейропептидов.
Масс-спектрометрия (МС) позволяет проводить высокопроизводительный анализ структуры и плотности нейропептидов. Это может быть выполнено с помощью различных методов МС, чаще всего жидкостной хроматографии-электрораспылительной ионизации MS (LC-ESI-MS)5 и матричной лазерной десорбции / ионизации MS (MALDI-MS)6. Используя высокоточные измерения массы и фрагментацию РС, МС обеспечивает возможность присваивать нейропептидам из сложных смесей статус последовательности аминокислот и посттрансляционной модификации (ПТМ) без априорных знаний, чтобы помочь в определении их функции 7,8. В дополнение к качественной информации, MS позволяет получать количественную информацию о нейропептидах с помощью количественного определения без меток (LFQ) или методов на основе этикеток, таких как изотопная или изобарическая маркировка9. Основные преимущества LFQ включают в себя его простоту, низкую стоимость анализа и снижение этапов подготовки образцов, что может минимизировать потери образца. Тем не менее, недостатки LFQ включают в себя увеличение затрат времени прибора, поскольку он требует нескольких технических реплик для устранения количественной ошибки от вариативности от запуска к запуску. Это также приводит к снижению способности точно количественно оценивать небольшие вариации. Методы на основе этикеток подвергаются менее систематическому изменению, поскольку несколько образцов могут быть дифференциально маркированы с использованием различных стабильных изотопов, объединены в один образец и проанализированы с помощью масс-спектрометрии одновременно. Это также увеличивает пропускную способность, хотя изотопные этикетки могут быть трудоемкими и дорогостоящими для синтеза или покупки. Спектральная сложность масс-спектров полного сканирования (MS1) также увеличивается по мере увеличения мультиплексирования, что уменьшает количество уникальных нейропептидов, которые могут быть фрагментированы и, следовательно, идентифицированы. И наоборот, изобарическая маркировка не увеличивает спектральную сложность на уровне MS1, хотя и создает проблемы для аналитов с низким содержанием, таких как нейропептиды. Поскольку изобарическое количественное определение выполняется на уровне масс-спектров фрагментов ионов (MS2), нейропептиды с низким содержанием могут быть не в состоянии быть количественно определены, поскольку для фрагментации могут быть выбраны более обильные компоненты матрицы, а выбранные могут не иметь достаточно высокого содержания для количественной оценки. С помощью изотопной маркировки количественное определение может быть выполнено для каждого идентифицированного пептида.
В дополнение к идентификации и количественной оценке, информация о локализации может быть получена РС с помощью визуализации MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Растрируя лазер по поверхности образца, ms-спектры могут быть скомпилированы в изображение тепловой карты для каждого значения m/z . Картирование интенсивности переходного нейропептидного сигнала в различных регионах в разных условиях может предоставить ценную информацию для определения функции11. Локализация нейропептидов особенно важна, поскольку функция нейропептидов может отличаться в зависимости от местоположения12.
Нейропептиды встречаются в меньшем количестве in vivo, чем другие сигнальные молекулы, такие как нейротрансмиттеры, и, таким образом, требуют чувствительных методов для обнаружения13. Это может быть достигнуто путем удаления компонентов матрицы с более высоким содержанием, таких как липиды11,14. Дополнительные соображения для анализа нейропептидов должны быть сделаны по сравнению с обычными рабочими процессами протеомики, главным образом потому, что большинство нейропептидомных анализов опускают ферментативное пищеварение. Это ограничивает программные возможности для анализа данных нейропептидов, поскольку большинство из них были построены с помощью алгоритмов, основанных на данных протеомики и совпадениях белков, основанных на обнаружении пептидов. Тем не менее, многие программы, такие как PEAKS15, больше подходят для анализа нейропептидов из-за их возможностей секвенирования de novo. Для анализа нейропептидов необходимо учитывать несколько факторов, начиная от метода экстракции до анализа данных РС.
Протоколы, описанные здесь, включают методы пробоподготовки и диметилизотопной маркировки, сбора данных и анализа данных нейропептидов LC-ESI-MS, MALDI-MS и MALDI-MSI. С помощью репрезентативных результатов нескольких экспериментов демонстрируется полезность и способность этих методов идентифицировать, количественно оценивать и локализовать нейропептиды синих крабов, Callinectes sapidus. Чтобы лучше понять нервную систему, обычно используются модельные системы. Многие организмы не имеют полностью секвенированного генома, что препятствует всестороннему открытию нейропептидов на пептидном уровне. Чтобы смягчить эту проблему, включен протокол для идентификации новых нейропептидов и анализа транскриптомов для создания баз данных для организмов без полной информации о геноме. Все представленные здесь протоколы могут быть оптимизированы для нейропептидных образцов из любых видов, а также применены для анализа любых эндогенных пептидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Точная идентификация, количественная оценка и локализация нейропептидов и эндогенных пептидов, обнаруженных в нервной системе, имеют решающее значение для понимания их функции23,24. Масс-спектрометрия является мощным методом, который может позволить дос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным научным фондом (CHE-1710140 и CHE-2108223) и Национальными институтами здравоохранения (NIH) через грант R01DK071801. A.P. был частично поддержан грантом NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. был частично поддержан Национальными институтами здравоохранения в рамках Премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы от Национального института сердца легких и крови в Центр сердечно-сосудистых исследований Университета Висконсина-Мэдисона (T32 HL007936). L.L. хотел бы отметить гранты NIH R56 MH110215, S10RR029531 и S10OD025084, а также финансовую поддержку от профессора выдающихся достижений Виласа и профессора Чарльза Мельбурна Джонсона с финансированием, предоставленным Исследовательским фондом выпускников Висконсина и Школой фармации Университета Висконсина-Мэдисона.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
