חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס
Summary
אפיון ספקטרומטרי של מסה של נוירופפטידים מספק מידע על רצף, כמות ולוקליזציה. זרימת עבודה אופטימלית זו שימושית לא רק למחקרי נוירופפטידים, אלא גם לפפטידים אנדוגניים אחרים. הפרוטוקולים המובאים כאן מתארים הכנת דגימות, רכישת טרשת נפוצה, ניתוח טרשת נפוצה ויצירת מסדי נתונים של נוירופפטידים באמצעות LC-ESI-MS, איתור MALDI-MS והדמיית MALDI-MS.
Abstract
נוירופפטידים מאותתים על מולקולות המווסתות כמעט את כל התהליכים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים, כגון התפתחות, רבייה, צריכת מזון ותגובה לגורמי עקה חיצוניים. עם זאת, המנגנונים הביוכימיים וההשלמה המלאה של הנוירופפטידים והתפקידים התפקודיים שלהם עדיין אינם מובנים היטב. אפיון הפפטידים האנדוגניים האלה נפגע על ידי המגוון העצום בתוך סוג זה של מולקולות איתות. בנוסף, נוירופפטידים הם ביו-אקטיביים בריכוזים נמוכים פי 100 – פי 1000 מזה של נוירוטרנסמיטורים והם נוטים להתפרקות אנזימטית לאחר שחרור סינפטי. ספקטרומטריית מסות (MS) היא כלי אנליטי רגיש ביותר שיכול לזהות, לכמת ולמקם אנליטים ללא ידע א-פריורי מקיף. הוא מתאים היטב ליצירת פרופיל גלובלי של נוירופפטידים ולסיוע בגילוי של פפטידים חדשים. בשל השפע הנמוך והמגוון הכימי הגבוה של סוג זה של פפטידים, מספר שיטות להכנת דגימות, פרמטרים לרכישת טרשת נפוצה ואסטרטגיות ניתוח נתונים הותאמו מטכניקות פרוטאומיקה כדי לאפשר אפיון נוירופפטידי אופטימלי. כאן מתוארות שיטות לבידוד נוירופפטידים מרקמות ביולוגיות מורכבות לצורך אפיון רצף, כמות ולוקליזציה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS וספיגת/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)-MS. פרוטוקול להכנת מסד נתונים נוירופפטידי מהסרטן הכחול, Callinectes sapidus, אורגניזם ללא מידע גנומי מקיף, נכלל. ניתן להתאים זרימות עבודה אלה לחקר סוגים אחרים של פפטידים אנדוגניים במינים שונים באמצעות מגוון מכשירים.
Introduction
מערכת העצבים מורכבת ודורשת רשת של נוירונים כדי להעביר אותות ברחבי האורגניזם. מערכת העצבים מתאמת מידע חושי ותגובה ביולוגית. האינטראקציות המורכבות והמפותלות המעורבות בהעברת אותות דורשות מולקולות איתות רבות ושונות כגון נוירוטרנסמיטורים, סטרואידים ונוירופפטידים. מכיוון שנוירופפטידים הם מולקולות האיתות המגוונות והחזקות ביותר הממלאות תפקידי מפתח בהפעלת תגובות פיזיולוגיות ללחץ ולגירויים אחרים, מעניין לקבוע את תפקידם הספציפי בתהליכים פיזיולוגיים אלה. תפקוד הנוירופפטידים קשור למבנה חומצות האמינו שלהם, הקובע את הניידות, האינטראקציה עם הקולטנים וזיקה1. טכניקות כגון היסטוכימיה, שהיא חשובה משום שניתן לסנתז, לאחסן ולשחרר נוירופפטידים באזורים שונים של הרקמה, ואלקטרופיזיולוגיה שימשה כדי לחקור את המבנה והתפקוד של הנוירופפטידים 2,3,4, אך שיטות אלה מוגבלות על ידי תפוקה וספציפיות כדי לפתור את מגוון הרצף העצום של הנוירופפטידים.
ספקטרומטריית מסות (MS) מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של מבנה נוירופפטידים ושפע. ניתן לבצע זאת באמצעות טכניקות שונות של טרשת נפוצה, בדרך כלל כרומטוגרפיה נוזלית-יינון אלקטרוספריי MS (LC-ESI-MS)5 ו-MS ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-MS)6. באמצעות מדידות מסה ברמת דיוק גבוהה ופיצול טרשת נפוצה, טרשת נפוצה מספקת את היכולת להקצות רצף חומצות אמינו ומצב של שינוי לאחר התרגום (PTM) לנוירופפטידים מתערובות מורכבות ללא ידע א-פריורי כדי לסייע באיתור תפקודם 7,8. בנוסף למידע איכותני, טרשת נפוצה מאפשרת מידע כמותי של נוירופפטידים באמצעות כמות ללא תוויות (LFQ) או שיטות מבוססות תווית כגון תיוג איזוטופי או איזוברי9. היתרונות העיקריים של LFQ כוללים את הפשטות שלו, עלות נמוכה של ניתוח, וירידה בשלבי הכנת הדגימה שיכולים למזער את אובדן הדגימה. עם זאת, החסרונות של LFQ כוללים עלויות זמן מכשיר מוגברות מכיוון שהוא דורש שכפולים טכניים מרובים כדי לטפל בשגיאות כמותיות מהשונות בריצה לריצה. זה גם מוביל לירידה ביכולת לכמת במדויק וריאציות קטנות. שיטות מבוססות תווית נתונות לשונות פחות שיטתית מכיוון שניתן לסמן דגימות מרובות באופן דיפרנציאלי באמצעות מגוון איזוטופים יציבים, לשלב אותן בדגימה אחת ולנתח אותן באמצעות ספקטרומטריית מסות בו זמנית. זה גם מגדיל את התפוקה, אם כי תוויות איזוטופיות יכולות לגזול זמן רב ויקר לסנתז או לרכוש. המורכבות הספקטרלית של ספקטרום מסת סריקה מלאה (MS1) עולה גם היא ככל שהריבוב עולה, מה שמקטין את מספר הנוירופפטידים הייחודיים המסוגלים להיות מפוצלים ולכן, מזוהים. לעומת זאת, תיוג איזוברי אינו מגביר את המורכבות הספקטרלית ברמת MS1, אם כי הוא מציב אתגרים לאנליטים בעלי שפע נמוך כגון נוירופפטידים. מכיוון שהכמות האיזוברית מתבצעת ברמת ספקטרום מסת יון השבר (MS2), ייתכן שלא ניתן יהיה לכמת נוירופפטידים בעלי שפע נמוך מכיוון שניתן לבחור רכיבי מטריצה שופעים יותר לפיצול וייתכן שלמי שנבחר אין שפע גבוה מספיק כדי לכמת אותם. עם תיוג איזוטופי, ניתן לבצע כמות על כל פפטיד מזוהה.
בנוסף לזיהוי וכימות, ניתן לקבל מידע לוקליזציה על ידי MS באמצעות הדמיית MALDI-MS (MALDI-MSI)10. על-ידי רסטר לייזר על פני משטח דגימה, ניתן לקמפל ספקטרה של MS לתמונת מפת חום עבור כל ערך m/z . מיפוי עוצמת האותות הנוירופפטידיים הארעיים באזורים שונים על פני מצבים שונים יכול לספק מידע רב ערך לקביעת תפקוד11. לוקליזציה של נוירופפטידים חשובה במיוחד מכיוון שתפקוד הנוירופפטידים עשוי להשתנות בהתאם למיקום12.
נוירופפטידים נמצאים בשפע נמוך יותר in vivo מאשר מולקולות איתות אחרות, כגון מוליכים עצביים, ולכן דורשים שיטות רגישות לגילוי13. ניתן להשיג זאת באמצעות הסרת רכיבי מטריצת שפע גבוהים יותר, כגון שומנים11,14. שיקולים נוספים לניתוח נוירופפטידים צריכים להיעשות בהשוואה לתהליכי עבודה נפוצים של פרוטאומיקה, בעיקר משום שרוב הניתוחים הנוירו-פפטידומיים משמיטים עיכול אנזימטי. זה מגביל את אפשרויות התוכנה לניתוח נתונים של נוירופפטידים מכיוון שרובם נבנו עם אלגוריתמים המבוססים על נתוני פרוטאומיקה והתאמות חלבונים המבוססות על זיהוי פפטידים. עם זאת, תוכנות רבות כגון PEAKS15 מתאימות יותר לניתוח נוירופפטידים בשל יכולות ריצוף דה נובו שלהן. יש לקחת בחשבון מספר גורמים לניתוח נוירופפטידים החל משיטת החילוץ ועד לניתוח נתוני טרשת נפוצה.
הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שיטות להכנת דגימות ותיוג איזוטופי של דימתיל, איסוף נתונים וניתוח נתונים של נוירופפטידים על ידי LC-ESI-MS, MALDI-MS ו-MALDI-MSI. באמצעות תוצאות מייצגות ממספר ניסויים, מדגימים את התועלת והיכולת של שיטות אלה לזהות, לכמת ולמקם נוירופפטידים מסרטנים כחולים, Callinectes sapidus. כדי להבין טוב יותר את מערכת העצבים, מערכות מודל משמשות בדרך כלל. לאורגניזמים רבים אין גנום ברצף מלא זמין, מה שמונע גילוי נוירופפטידי מקיף ברמת הפפטיד. על מנת למתן את האתגר הזה, נכלל פרוטוקול לזיהוי נוירופפטידים חדשים וכריית תעתיקים ליצירת מסדי נתונים עבור אורגניזמים ללא מידע גנומי מלא. כל הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים להיות מותאמים לדגימות נוירופפטידים מכל מין, כמו גם ליישם לניתוח של כל פפטידים אנדוגניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזיהוי המדויק, הכימות והלוקליזציה של נוירופפטידים ופפטידים אנדוגניים שנמצאים במערכת העצבים חיוניים להבנת תפקודם23,24. ספקטרומטריית מסות היא טכניקה רבת עוצמה שיכולה לאפשר לכל זה להתבצע, אפילו באורגניזמים ללא גנום בעל רצף מלא. מדגימה היכולת של פרוטוקול זה לז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (CHE-1710140 ו- CHE-2108223) ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) באמצעות מענק R01DK071801. A.P. נתמך בחלקו על ידי מענק ההדרכה לממשק כימיה-ביולוגיה של NIH (T32 GM008505). N.V.Q. נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס שירות המחקר הלאומי של רות ל. קירששטיין מהמכון הלאומי לריאות ודם ללב למרכז לחקר הלב וכלי הדם של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (T32 HL007936). L.L. רוצה להכיר במענקי NIH R56 MH110215, S10RR029531 ו- S10OD025084, כמו גם תמיכה במימון של פרופסורה להישגים מצטיינים של וילאס ופרופסור צ’ארלס מלבורן ג’ונסון במימון הקרן לחקר בוגרי ויסקונסין ובית הספר לרוקחות של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
