Détermination de la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogéniques
Summary
Le protocole présente deux méthodes pour déterminer la cinétique des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 et Brocoli. La première méthode décrit comment mesurer la cinétique des aptamères fluorogéniques in vitro avec un lecteur de plaques, tandis que la deuxième méthode détaille la mesure de la cinétique des aptamères fluorogéniques dans les cellules par cytométrie en flux.
Abstract
Des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été appliqués dans des cellules vivantes pour marquer et visualiser les ARN, rendre compte de l’expression des gènes et activer des biocapteurs fluorescents qui détectent les niveaux de métabolites et de molécules de signalisation. Afin d’étudier les changements dynamiques dans chacun de ces systèmes, il est souhaitable d’obtenir des mesures en temps réel, mais la précision des mesures dépend de la cinétique de la réaction fluorogénique plus rapide que la fréquence d’échantillonnage. Ici, nous décrivons des méthodes pour déterminer la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogénique à l’aide d’un lecteur de plaques équipé respectivement d’un injecteur d’échantillon et d’un cytomètre en flux. Nous montrons que la cinétique in vitro pour l’activation de fluorescence des aptamères Spinach2 et Brocoli peut être modélisée comme des réactions d’association à deux phases et ont différentes constantes de vitesse de phase rapide de 0,56 s-1 et 0,35 s-1, respectivement. De plus, nous montrons que la cinétique cellulaire pour l’activation de fluorescence des épinards2 chez Escherichia coli, qui est encore limitée par la diffusion du colorant dans les bactéries à Gram négatif, est encore suffisamment rapide pour permettre une fréquence d’échantillonnage précise sur l’échelle de temps infime. Ces méthodes d’analyse de la cinétique d’activation de fluorescence sont applicables à d’autres aptamères d’ARN fluorogéniques qui ont été développés.
Introduction
Les réactions fluorogéniques sont des réactions chimiques qui génèrent un signal de fluorescence. Les aptamères d’ARN fluorogénique remplissent généralement cette fonction en liant un colorant à petite molécule pour améliorer son rendement quantique de fluorescence (Figure 1A)1. Différents systèmes d’aptamères d’ARN fluorogéniques ont été développés et se composent de séquences d’aptamères d’ARN spécifiques et des ligands colorants correspondants1. Des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été ajoutés aux transcrits d’ARN sous forme de marqueurs fluorescents qui permettent l’imagerie de cellules vivantes d’ARNm et d’ARN non codants 2,3,4. Ils ont également été placés après des séquences promotrices en tant que rapporteurs fluorescents de l’expression génique, similaire à l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) comme rapporteur, sauf que la fonction de déclaration est au niveau de l’ARN 5,6. Enfin, des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été incorporés dans des biocapteurs fluorescents à base d’ARN, conçus pour déclencher la réaction fluorogénique en réponse à une petite molécule spécifique. Des biocapteurs fluorescents à base d’ARN ont été développés pour l’imagerie de cellules vivantes de divers métabolites non fluorescents et molécules de signalisation 7,8,9,10,11.
Il y a un intérêt croissant pour le développement d’aptamères d’ARN fluorogéniques pour visualiser les changements dynamiques dans la localisation de l’ARN, l’expression des gènes et les signaux de petites molécules. Pour chacune de ces applications, il est souhaitable d’obtenir des mesures en temps réel, mais la précision des mesures dépend de la cinétique de la réaction fluorogénique plus rapide que la fréquence d’échantillonnage. Ici, nous décrivons des méthodes pour déterminer la cinétique in vitro des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 12 et Brocoli13 à l’aide d’un lecteur de plaques équipé d’un injecteur d’échantillon et pour déterminer la cinétique d’activation cellulaire pourSpinach2 exprimée dans Escherichia coli à l’aide d’un cytomètre en flux. Ces deux aptamères d’ARN ont été choisis parce qu’ils ont été appliqués pour étudier la localisation de l’ARN 2,3,4, ils ont été utilisés dans les rapporteurs5,6 et les biocapteurs 7,8,9,10,11, et les ligands colorants correspondants (DFHBI ou DFHBI-1T) sont disponibles dans le commerce. Un résumé de leurs propriétés in vitro déterminées dans la littérature est présenté dans le tableau 1 4,13,14, qui a éclairé l’élaboration du protocole (p. ex., les longueurs d’onde et les concentrations de colorant utilisées). Ces résultats démontrent que les réactions fluorogéniques affectées par les aptamères d’ARN sont rapides et ne devraient pas empêcher des mesures précises pour les applications biologiques cellulaires souhaitées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour l’expérience de cinétique in vitro, le même protocole général peut être modifié pour mesurer la cinétique in vitro d’un biocapteur fluorescent à base d’ARN contenant à la fois un domaine de liaison au ligand et un domaine de liaison au fluorophore 8. Dans ce cas, l’ARN doit être incubé avec le fluorophore avant les mesures lors de l’injection du ligand afin d’obtenir la cinétique de réponse du ligand. Si une grande variabilité est observée entre l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à MCH: NSF-BSF 1815508 et NIH R01 GM124589. MRM a été partiellement soutenu par la subvention de formation NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
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