Summary

Determinação da Cinética de Ativação In Vitro e Celular para Aptamers de RNA Fluorogênico

Published: August 09, 2022
doi:

Summary

O protocolo apresenta dois métodos para determinar a cinética dos aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 e Brócolis. O primeiro método descreve como medir a cinética do aptâmero fluorogênico in vitro com um leitor de placas, enquanto o segundo método detalha a medição da cinética do aptâmero fluorogênico nas células por citometria de fluxo.

Abstract

Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido aplicados em células vivas para marcar e visualizar RNAs, relatar a expressão gênica e ativar biossensores fluorescentes que detectam níveis de metabólitos e moléculas de sinalização. Para estudar as mudanças dinâmicas em cada um desses sistemas, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética de ativação in vitro e celular para aptâmeros de RNA fluorogênicos usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e um citômetro de fluxo, respectivamente. Mostramos que a cinética in vitro para a ativação por fluorescência dos aptâmeros Espinafre2 e Brócolis pode ser modelada como reações de associação bifásica e tem diferentes constantes de taxa de fase rápida de 0,56 s−1 e 0,35 s−1, respectivamente. Além disso, mostramos que a cinética celular para a ativação por fluorescência do Espinafre2 em Escherichia coli, que é ainda mais limitada pela difusão do corante nas bactérias Gram-negativas, ainda é suficientemente rápida para permitir uma frequência de amostragem precisa na escala de tempo minuto. Esses métodos para analisar a cinética de ativação por fluorescência são aplicáveis a outros aptâmeros de RNA fluorogênicos que foram desenvolvidos.

Introduction

Reações fluorogênicas são reações químicas que geram um sinal de fluorescência. Os aptâmeros de RNA fluorogênicos normalmente desempenham essa função ligando um corante de molécula pequena para aumentar seu rendimento quântico de fluorescência (Figura 1A)1. Diferentes sistemas de aptâmeros de RNA fluorogênicos foram desenvolvidos e consistem em sequências específicas de aptâmeros de RNA e os ligantes corantes correspondentes1. Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido anexados a transcritos de RNA como etiquetas fluorescentes que permitem a imagem de células vivas de mRNAs e RNAs não codificantes 2,3,4. Eles também foram colocados após sequências promotoras como repórteres fluorescentes de expressão gênica, semelhante ao uso de proteína fluorescente verde (GFP) como repórter, exceto que a função de relato está no nível de RNA 5,6. Finalmente, os aptâmeros de RNA fluorogênicos foram incorporados em biossensores fluorescentes baseados em RNA, que são projetados para desencadear a reação fluorogênica em resposta a uma pequena molécula específica. Biossensores fluorescentes baseados em RNA foram desenvolvidos para imagens de células vivas de vários metabólitos não fluorescentes e moléculas sinalizadoras 7,8,9,10,11.

Há um interesse crescente no desenvolvimento de aptâmeros de RNA fluorogênicos para visualizar mudanças dinâmicas na localização do RNA, expressão gênica e sinais de moléculas pequenas. Para cada uma dessas aplicações, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética in vitro para os aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 12 e Brócolis13 usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e para determinar a cinética de ativação celular para Espinafre2 expressa em Escherichia coli usando um citômetro de fluxo. Esses dois aptâmeros de RNA foram escolhidos por terem sido aplicados para estudar a localização do RNA 2,3,4, terem sido utilizados em repórteres 5,6 e biossensores 7,8,9,10,11, e os ligantes corantes correspondentes (DFHBI ou DFHBI-1T) estarem comercialmente disponíveis. Um resumo de suas propriedades in vitro determinadas na literatura é apresentado na Tabela 1 4,13,14, que informou o desenvolvimento do protocolo (por exemplo, os comprimentos de onda e as concentrações de corantes utilizados). Esses resultados demonstram que as reações fluorogênicas afetadas pelos aptâmeros de RNA são rápidas e não devem impedir medições precisas para as aplicações biológicas celulares desejadas.

Protocol

1. Experimento de cinética in vitro Preparação de moldes de ADN por PCRConfigurar reação(ões) de PCR: Para preparar reações de PCR, combine os seguintes reagentes em um tubo de PCR de paredes finas:33 μL de água duplamente destilada (ddH2O)10 μL de tampão 5x para DNA polimerase de alta fidelidade5 μL de 2 mM de cada trifosfato desoxirribonucleosídeo (dNTP)0,5 μL de 40 μM de primer para a frente0,5 μL de primer reverso de 40 μM<br…

Representative Results

Cinética in vitro As sequências dos moldes e primers de DNA, que são adquiridos como oligonucleotídeos sintéticos, são mostradas na Tabela 2, e as receitas de reagentes são mostradas no Arquivo Suplementar 1. A amplificação por PCR é usada para aumentar a quantidade de molde de DNA com o promotor T7, que é necessário para a reação subsequente de transcrição in vitro (IVT). Além disso, a amplificação por PCR pode s…

Discussion

Para o experimento de cinética in vitro , o mesmo protocolo geral pode ser modificado para medir a cinética in vitro de um biossensor fluorescente baseado em RNA contendo um domínio de ligação ao ligante e de ligação ao fluoróforo8. Neste caso, o RNA deve ser incubado com o fluoróforo antes das medições após a injeção do ligante, a fim de obter cinética de resposta do ligante. Se for observada alta variabilidade entre as replicações, pode-se solucionar problemas …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções à MCH: NSF-BSF 1815508 e NIH R01 GM124589. O MRM foi parcialmente apoiado pela bolsa de treinamento NIH T32 GM122740.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

References

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Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

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