Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Bestimmung der in vitro und zellulären Einschaltkinetik für fluorogene RNA-Aptamere

Published: August 09, 2022

doi:

Madeline M. Mumbleau*¹, Madeline R. Meyer*¹, Ming C. Hammond

¹Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science,University of Utah

Summary

Das Protokoll stellt zwei Methoden vor, um die Kinetik der fluorogenen RNA-Aptamere Spinat2 und Brokkoli zu bestimmen. Die erste Methode beschreibt, wie die fluorogene Aptamerkinetik in vitro mit einem Plattenleser gemessen werden kann, während die zweite Methode die Messung der fluorogenen Aptamerkinetik in Zellen durch Durchflusszytometrie beschreibt.

Abstract

Fluorogene RNA-Aptamere wurden in lebenden Zellen eingesetzt, um RNAs zu markieren und sichtbar zu machen, über die Genexpression zu berichten und fluoreszierende Biosensoren zu aktivieren, die Konzentrationen von Metaboliten und Signalmolekülen erkennen. Um dynamische Änderungen in jedem dieser Systeme zu untersuchen, ist es wünschenswert, Echtzeitmessungen zu erhalten, aber die Genauigkeit der Messungen hängt davon ab, ob die Kinetik der fluorogenen Reaktion schneller ist als die Probenahmefrequenz. Hier beschreiben wir Methoden zur Bestimmung der in vitro und zellulären Einschaltkinetik für fluorogene RNA-Aptamere mit einem Plattenleser, der mit einem Probeninjektor bzw. einem Durchflusszytometer ausgestattet ist. Wir zeigen, dass die in vitro Kinetik für die Fluoreszenzaktivierung der Spinat2- und Brokkoli-Aptamere als zweiphasige Assoziationsreaktionen modelliert werden kann und unterschiedliche schnelle Phasenratenkonstanten von 0,56 s−1 bzw. 0,35 s⁻¹ aufweist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die zelluläre Kinetik für die Fluoreszenzaktivierung von Spinat2 in Escherichia coli, die durch die Farbstoffdiffusion in die gramnegativen Bakterien weiter begrenzt wird, immer noch schnell genug ist, um eine genaue Probenhäufigkeit auf der Minutenskala zu ermöglichen. Diese Methoden zur Analyse der Fluoreszenzaktivierungskinetik sind auf andere fluorogene RNA-Aptamere anwendbar, die entwickelt wurden.

Introduction

Fluorogene Reaktionen sind chemische Reaktionen, die ein Fluoreszenzsignal erzeugen. Fluorogene RNA-Aptamere erfüllen diese Funktion typischerweise, indem sie einen kleinmolekularen Farbstoff binden, um seine Fluoreszenzquantenausbeute zu erhöhen (Abbildung 1A)¹. Verschiedene fluorogene RNA-Aptamersysteme wurden entwickelt und bestehen aus spezifischen RNA-Aptamersequenzen und den entsprechenden Farbstoffliganden¹. Fluorogene RNA-Aptamere wurden an RNA-Transkripte als fluoreszierende Tags angehängt, die die Bildgebung lebender Zellen von mRNAs und nicht-kodierenden RNAs^ermöglichen ^2,3,4. Sie wurden auch nach Promotorsequenzen als fluoreszierende Reporter der Genexpression platziert, ähnlich der Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Reporter, außer dass die Berichtsfunktion auf der RNA-Ebene ^5,6 liegt. Schließlich wurden fluorogene RNA-Aptamere in RNA-basierte fluoreszierende Biosensoren eingebaut, die die fluorogene Reaktion als Reaktion auf ein bestimmtes kleines Molekül auslösen sollen. RNA-basierte fluoreszierende Biosensoren wurden für die Lebendzellbildgebung verschiedener nicht-fluoreszierender Metaboliten und Signalmoleküle 7,8,9,10,11 entwickelt.

Es besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung fluorogener RNA-Aptamere zur Visualisierung dynamischer Veränderungen der RNA-Lokalisierung, der Genexpression und der niedermolekularen Signale. Für jede dieser Anwendungen ist es wünschenswert, Echtzeitmessungen zu erhalten, aber die Genauigkeit der Messungen hängt davon ab, ob die Kinetik der fluorogenen Reaktion schneller ist als die Probenahmefrequenz. Hier beschreiben wir Methoden zur Bestimmung der in vitro Kinetik für fluorogene RNA-Aptamere Spinat2¹² und Brokkoli¹³ mit einem mit einem Probeninjektor ausgestatteten Plattenleser und zur Bestimmung der zellulären Einschaltkinetik für Spinat2 exprimiert in Escherichia coli mittels Durchflusszytometer. Diese beiden RNA-Aptamere wurden ausgewählt, weil sie zur Untersuchung der RNA-Lokalisierung ^2,3,4 eingesetzt wurden, sie wurden in den Reportern^5,6 und Biosensoren 7,8,9,10,11 verwendet und die entsprechenden Farbstoffliganden (DFHBI oder DFHBI-1T) sind kommerziell erhältlich. Eine Zusammenfassung ihrer in der Literatur ermittelten In-vitro-Eigenschaften ist in Tabelle 1 4,13,14 enthalten^, die in die Entwicklung des Protokolls einflossen (z. B. die verwendeten Wellenlängen und Farbstoffkonzentrationen). Diese Ergebnisse zeigen, dass die fluorogenen Reaktionen, die von RNA-Aptameren beeinflusst werden, schnell sind und genaue Messungen für die gewünschten zellbiologischen Anwendungen nicht behindern sollten.

Protocol

1. In-vitro-Kinetik-Experiment Herstellung von DNA-Templates mittels PCRPCR-Reaktion(en) einrichten: Zur Vorbereitung von PCR-Reaktionen kombinieren Sie die folgenden Reagenzien in einem dünnwandigen PCR-Röhrchen:33 μL doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)10 μL 5x Puffer für High-Fidelity-DNA-Polymerase5 μL je 2 mM Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP)0,5 μL 40 μM Vorwärtsprimer0,5 μL 40 μM Reverse-Primer0,5 μL (10-100 ng) DNA-Vorl…

Representative Results

In-vitro-Kinetik Die Sequenzen der DNA-Vorlagen und Primer, die als synthetische Oligonukleotide gekauft werden, sind in Tabelle 2 und die Reagenzienrezepte in der Zusatzdatei 1 aufgeführt. Die PCR-Amplifikation wird verwendet, um die Menge der DNA-Vorlage mit dem T7-Promotor zu erhöhen, die für die nachfolgende In-vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) erforderlich ist. Darüber hinaus kann die PCR-Amplifikation für zwei Zwecke in…

Discussion

Für das In-vitro-Kinetik-Experiment kann das gleiche allgemeine Protokoll modifiziert werden, um die In-vitro-Kinetik eines RNA-basierten fluoreszierenden Biosensors zu messen, der sowohl eine ligandenbindende als auch eine fluorophorbindende Domäne⁸ enthält. In diesem Fall sollte die RNA vor Messungen nach Injektion des Liganden mit dem Fluorophor inkubiert werden, um eine Ligandenantwortkinetik zu erhalten. Wenn eine hohe Variabilität zwischen den Replikaten beobachtet wir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse an MCH unterstützt: NSF-BSF 1815508 und NIH R01 GM124589. MRM wurde teilweise durch das Ausbildungsstipendium NIH T32 GM122740 unterstützt.

Materials

Agarose	Thermo Fischer Scientific	BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment	Thermo Fischer Scientific	B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate	Thermo Fischer Scientific	18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	22431021
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Ammonium sulfate ((NH₄)₂SO₄)	Sigma-Aldrich	A4418
Attune NxT Flow cytometer	Thermo Fischer Scientific	A24861
Attune 1x Focusing Fluid	Thermo Fischer Scientific	A24904
Attune Shutdown Solution	Thermo Fischer Scientific	A24975
Attune Performance Tracking Beads	Thermo Fischer Scientific	4449754
Attune Wash Solution	Thermo Fischer Scientific	J24974
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Chlorine Bleach	Amazon	B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate	Daigger Scientific	EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap	Globe Scientific	05-402-31
DFHBI	Sigma-Aldrich	SML1627
DFHBI-1T	Sigma-Aldrich	SML2697
D-Glucose (anhydrous)	Acros Organics	AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
DNA loading dye	New England Biolabs	B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL)	Eppendorf	22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP	New England Biolabs	N0446S
EDTA, pH 8.0	Gibco, Life Technologies	AM9260G
Ethanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	E7023
Filter-tip micropipettor tips	Thermo Fischer Scientific	AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software	BD Biosciences	N/A	FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control	VWR	10014-924
Gel electrophoresis power supply	Thermo Fischer Scientific	EC3000XL2
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycogen AM95010	Thermo Fischer Scientific	AM95010
GraphPad Prism	Dotmatics	N/A	Analysis software from Academic Group License
Heat block	Thomas Scientific	1159Z11
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder	New England Biolabs	N3233L	Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl₂)	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium sulfate (MgSO₄)	Fisher Scientific	MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Eppendorf	22363204
Microcentrifuge with temperature control	Marshall Scientific	EP-5415R
Micropipettors	Gilson	FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips	Sigma-Aldrich	Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit	Sigma-Aldrich	CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips	DOT Scientific	RN005R-LRS
PBS, 10x	Thermo Fischer Scientific	BP39920
PCR clean-up kit	Qiagen	28181
PCR primers and templates	Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes	Bio-Rad	1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes	Techne	5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid	Addgene	Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530L	Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl₂ and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific	C.B.S. Scientific	VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment	C.B.S. Scientific	ASG-250
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Razor blades	Genesee Scientific	38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP	New England Biolabs	N0450L
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
Short wave UV light source	Thermo Fischer Scientific	11758221
Sodium carbonate (Na₂CO₃)	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Thermo Fischer Scientific	S375-500
SoftMax Pro	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units	Thermo Fischer Scientific	09-741-88
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SYBR Safe DNA gel stain	Thermo Fischer Scientific	S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis	Thermo Fischer Scientific	AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Tryptone (granulated)	Thermo Fischer Scientific	M0251S
T7 RNA polymerase	New England Biolabs	M0251S
Urea-PAGE Gel system	National Diagnostics	EC-833
UV fluorescent TLC plate	Sigma-Aldrich	1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific	ND-8000-GL
Vortex mixer	Thermo Fischer Scientific	2215415
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126
Yeast Extract (Granulated)	Thermo Fischer Scientific	BP9727-2

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Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).