Summary

蛍光発生RNAアプタマーの in vitro および細胞ターンオン動態の決定

Published: August 09, 2022
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Summary

このプロトコルは、蛍光発生RNAアプタマーであるホウレンソウ2とブロッコリーの動態を決定するための2つの方法を提示します。最初の方法では、プレートリーダーを使用してin vitro で蛍光発生アプタマー動態を測定する方法を説明し、2番目の方法では、フローサイトメトリーによる細胞内の蛍光発生アプタマー動態の測定を詳述します。

Abstract

蛍光発生RNAアプタマーは、RNAのタグ付けと視覚化、遺伝子発現の報告、代謝物やシグナル伝達分子のレベルを検出する蛍光バイオセンサーの活性化のために生細胞に適用されています。これらの各システムの動的変化を研究するためには、リアルタイムの測定値を得ることが望ましいが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存する。ここでは、試料注入器とフローサイトメーターを備えたプレートリーダーを使用して、蛍光発生RNAアプタマーのin vitroおよび細胞のターンオン速度を決定する方法について説明します。ホウレンソウ2とブロッコリーのアプタマーの蛍光活性化のin vitro動態は、二相会合反応としてモデル化でき、それぞれ0.56 s-1と0.35 s-1の異なる高速相速度定数を持つことを示しています。さらに、グラム陰性菌への色素拡散によってさらに制限される大腸におけるホウレンソウ2の蛍光活性化の細胞動態は、微小なタイムスケールで正確なサンプリング周波数を可能にするのに十分迅速であることを示しています。蛍光活性化速度論を解析するこれらの方法は、開発されている他の蛍光発生RNAアプタマーに適用可能である。

Introduction

蛍光発生反応は、蛍光シグナルを生成する化学反応です。蛍光発生RNAアプタマーは通常、低分子色素を結合させて蛍光量子収率を高めることでこの機能を果たします(図1A)1。異なる蛍光発生RNAアプタマーシステムが開発されており、特定のRNAアプタマー配列および対応する色素リガンドからなる1。蛍光発生RNAアプタマーは、mRNAおよびノンコーディングRNAの生細胞イメージングを可能にする蛍光タグとしてRNA転写物に付加されています2,3,4それらはまた、レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の使用と同様に、遺伝子発現の蛍光レポーターとしてプロモーター配列の後に配置されていますが、報告機能はRNAレベル5,6です。最後に、蛍光発生RNAアプタマーは、特定の低分子に応答して蛍光発生反応を引き起こすように設計されたRNAベースの蛍光バイオセンサーに組み込まれています。RNAベースの蛍光バイオセンサーは、様々な非蛍光代謝物およびシグナル伝達分子の生細胞イメージングのために開発されている7891011

RNAの局在、遺伝子発現、および低分子シグナルの動的な変化を可視化するための蛍光発生RNAアプタマーの開発への関心が高まっています。これらの各アプリケーションでは、リアルタイムの測定値を取得することが望ましいですが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存します。ここでは、試料注入器を備えたプレートリーダーを用いて蛍光発生RNAアプタマーSmallach2 12およびBroccoli13in vitro動態を決定する方法と、フローサイトメーターを使用して大腸菌で発現するSpinach2の細胞ターンオン動態を決定する方法について説明します。これら2つのRNAアプタマーが選ばれたのは、RNA局在2,3,4の研究に適用されており、ポーター5,6およびバイオセンサー7,8,9,10,11で使用されており、対応する色素リガンド(DFHBIまたはDFHBI-1T)が市販されているためです。文献で決定されたそれらのインビトロ特性の要約は表141314に与えられ、これはプロトコール開発(例えば使用される波長および色素濃度)を知らせた。これらの結果は、RNAアプタマーの影響を受ける蛍光発生反応が迅速であり、目的の細胞生物学的用途の正確な測定を妨げるべきではないことを示しています。

Protocol

1. インビトロ 動態実験 PCRによるDNAテンプレートの調製PCR反応のセットアップ:PCR反応を準備するには、薄肉PCRチューブで次の試薬を混ぜ合わせます。33 μL の二重蒸留水 (ddH2O)10 μLの5xバッファー(ハイフィデリティDNAポリメラーゼ用)デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)2 mM各5 μL0.5 μL 40 μM フォワードプライマー0.5 μL の 40 μM リバー?…

Representative Results

インビトロ 動態合成オリゴヌクレオチドとして購入したDNAテンプレートとプライマーの配列を 表2 に、試薬レシピを 補足ファイル1に示します。PCR増幅は、その後の in vitro 転写(IVT)反応に必要なT7プロモーターによるDNAテンプレートの量をスケールアップするために使用されます。さらに、PCR増幅は、プライマー伸長による?…

Discussion

インビトロ動態実験のために、同じ一般的なプロトコルを変更して、リガンド結合ドメインとフルオロフォア結合ドメインの両方を含むRNAベースの蛍光バイオセンサーのインビトロ動態を測定することができます8 この場合、リガンド応答速度論を得るために、リガンドを注入する際の測定前にRNAを蛍光色素とともにインキュベートする必要があります。反?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、MCHへの次の助成金によってサポートされました:NSF-BSF 1815508およびNIH R01 GM124589。MRMは、トレーニング助成金NIH T32 GM122740によって部分的にサポートされました。

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

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Cite This Article
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

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