该方案介绍了两种测定荧光RNA适体Spinach2和Broccoli动力学特性的方法。第一种方法描述了如何测量荧光适体的动力学参数 体外 使用酶标仪进行检测，而第二种方法详细描述了通过流式细胞术测量细胞中荧光生成型适配体动力学的过程。
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摘要
摘要
荧光生成型RNA适体已被应用于活细胞中，用于标记和可视化RNA、报告基因表达，以及激活可检测代谢物和信号分子水平的荧光生物传感器。为了研究上述每个系统的动态变化，理想情况下需获得实时测量数据，但测量的准确性取决于荧光生成反应的动力学速度是否快于采样频率。本文描述了测定 体外 使用配备样品注射器的酶标仪和流式细胞仪，分别测定荧光生成型RNA适体的细胞群体激活动力学和单细胞激活动力学。我们证明了 体外 Spinach2和Broccoli适体荧光激活的动力学可建模为双相缔合反应，其快速相速率常数分别为0.56 s⁻¹−1 和 0.35 秒−1分别。此外，我们显示了Spinach2荧光激活的细胞动力学过程 大肠杆菌，尽管染料向革兰氏阴性菌的扩散会进一步限制其效果，但仍足够快速，可在分钟级时间尺度上实现准确的采样频率。这些分析荧光激活动力学的方法同样适用于已开发的其他荧光原生RNA适体。
引言
荧光生成反应是指能够产生荧光信号的化学反应。荧光生成RNA适体通常通过结合小分子染料以增强其荧光量子产率来实现这一功能（图1A）1。目前已开发出多种不同的荧光生成RNA适体系统，每种系统均由特定的RNA适体序列及其对应的染料配体组成1。荧光生成RNA适体已被作为荧光标签连接到RNA转录本上，用于在活细胞中对mRNA和非编码RNA进行成像2,3,4。它们还被置于启动子序列之后，作为基因表达的荧光报告元件，其作用类似于绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子，但其报告功能发生在RNA水平5,6。最后，荧光生成RNA适体已被整合到基于RNA的荧光生物传感器中，这类传感器被设计为在响应特定小分子时触发荧光生成反应。基于RNA的荧光生物传感器已成功用于活细胞中多种非荧光代谢物和信号分子的成像研究7,8,9
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方案
1. 体外 动力学实验
- 通过PCR制备DNA模板
- 设置PCR反应：准备PCR反应时，将以下试剂加入薄壁PCR管中：
33 µL 双蒸水（ddH2O
高保真DNA聚合酶用5倍缓冲液10 µL
2 mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各 5 µL
0.5 µL 40 µM 正向引物
0.5 µL 40 µM 反向引物
0.5 µL（10–100 ng）DNA 模板（仅用于 Spinach2 PCR；Broccoli 引物存在重叠）
0.5 µL 高保真DNA聚合酶（最后加入）
注意：合成寡核苷酸通常以干粉形式运输。配制储存液时，加入已知体积的无核酸酶水（推荐100 µL）。2O，并测量A260 使用该溶液测定其浓度，依据朗伯-比尔定律，其中消光系数可通过在线邻近碱基对法则计算。随后可利用该储备液配制适用于PCR的适当稀释液。 - 运行热循环仪程序。
- 使用以下热循环仪程序扩增全长 Spinach2 和 Broccoli DNA 模板：
初始变性：98 °C，2 分钟
35 个循环：
变性：98 °C 变性 15 秒
退火：72 °C，30 s
延伸：72 °C，30....
- 使用以下热循环仪程序扩增全长 Spinach2 和 Broccoli DNA 模板：
- 设置PCR反应：准备PCR反应时，将以下试剂加入薄壁PCR管中：
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结果
体外动力学
合成寡核苷酸购自供应商，其DNA模板和引物序列见表2，试剂配方见补充文件1。通过PCR扩增增加含有T7启动子的DNA模板数量，以用于后续的体外转录（IVT）反应。此外，PCR扩增可在同一反应中实现两个目的：通过引物延伸生成全长的Broccoli DNA模板，同时扩增DNA模板的量。
体外转录（IVT）反应合成RNA后，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化可去除全长RNA产物中存在的任何不需要的截短转录本、降解产物以及未反应的核糖核苷三磷酸（rNTP）。首选此类纯化方法，是因为截短或降解的RNA会导致RNA浓度测定不准确。由于核苷酸碱基可吸收紫外光，因此在紫外光照射下，凝胶上的RNA条带和rNTP可在荧光薄层色谱（TLC）板背景上以阴影形式显现。因此，可选择性地切取对应于正确产物大小的条带进行回收。
最近邻法由于未考虑碱基配对引起的减色效应，.......
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讨论
对于 体外 动力学实验，可对相同的一般性方案进行修改以测量 体外 基于RNA的荧光生物传感器的动力学研究，该传感器包含配体结合域和荧光团结合域8在此情况下，应在加入配体之前，先将RNA与荧光染料孵育，以便在注入配体后测量配体响应动力学。若在重复样本间观察到较高的变异性，可通过检查每个样本在96孔板中测量前是否均经过相同时间的平衡来排查问题。每个样本或重复应分别在单独孔中制备，并在15分钟平衡步骤结束后立即测量，而不是一次性制备所有样本。
对于细胞动力学实验，可根据需要缩短或延长实验时间，但必须提前规划好生物学重复的次数，并相应调整所需的细胞溶液体积。建议每次生物学重复的检测间隔控制在30秒至1分钟之间，以确保有充足时间仔细完成每一步操作。另一种改进方法是测试使用一种不与RNA适体结合的荧光原性染料作为替代的阴性对照，该对照不应表现出超出背景水平的荧光激活。若观察到结果不一致，可通过检查流式细胞仪在不同实验运行之间是否已按照制造商的协议进行彻底清洗，以排除前一次实验的细胞或染料残留对后续实验的干扰。<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了以下基金对 MCH 的资助：NSF-BSF 1815508 和 NIH R01 GM124589。MRM 部分得到了培训基金 NIH T32 GM122740 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| 琼脂糖凝胶电泳设备 | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| α-D-(+)-乳糖一水合物 | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| 琥珀色 1.5 mL 微量离心管 | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 硫酸铵（(NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT 流式细胞仪 | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x 聚焦液 | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune 关机溶液 | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune 性能追踪微球 | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune 清洗液 | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| 羧苄青霉素二钠盐 | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| 含氯漂白剂 | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96 孔板 | Daigger Scientific | EF86610A | |
| 培养管，12 mm × 75 mm，5 mL，带双位置盖 | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-葡萄糖（无水） | Acros Organics | AC410955000 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA 上样染料 | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind 管（2.0 mL） | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA，pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| 乙醇（EtOH） | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 带滤芯的移液器吸头 | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo 软件 | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 软件 |
| 带加热控制的荧光酶标仪 | VWR | 10014-924 | |
| 凝胶电泳电源 | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 糖原 AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | 来自学术团体许可的分析软件 |
| 加热块 | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| 无机焦磷酸酶 | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| 低分子量 DNA Marker | New England Biolabs | N3233L | 随附一管免费的紫色胶上样染料（6×），不含 SDS（NEB #B7025）。 |
| 六水合氯化镁（MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| 硫酸镁（MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| 微量离心管（1.5 mL） | Eppendorf | 22363204 | |
| 带温控的微量离心机 | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| 移液器 | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| 移液器吸头 | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| 带 BioPak 单元的 Millipore 水过滤器 | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| 窄口移液器吸头 | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS，10× | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28181 | |
| PCR 引物和模板 | Integrated DNA technologies | ||
| 用于薄壁 PCR 管的 PCR 扩增仪 | Bio-Rad | 1851148 | |
| 用于 0.5 mL 管的 PCR 扩增仪 | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 质粒 | Addgene | 质粒 #79783 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0530L | 购买 Phusion 高保真酶时，会附带提供 5× Phusion HF 缓冲液、5× Phusion GC 缓冲液，以及 MgCl2 和 DMSO 溶液。 |
| 聚丙烯酰胺凝胶电泳梳子，C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| 聚丙烯酰胺凝胶电泳设备 | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 刀片 | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs：ATP、CTP、GTP、UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| 短波紫外光源 | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| 碳酸钠（Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 无水磷酸氢二钠 | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | 通过学术团体许可获得的 SoftMax Pro 6.5.1（酶标仪软件） |
| 无菌过滤装置 | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA 凝胶染色剂 | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| 琼脂糖凝胶电泳用 TAE 缓冲液 | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| 胰蛋白胨（颗粒状） | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0251S | |
| 尿素-PAGE 凝胶系统 | National Diagnostics | EC-833 | |
| 紫外荧光 TLC 板 | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| 涡旋混合器 | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| 二甲苯氰蓝 | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| 酵母提取物（颗粒状） | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
参考文献
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial ....
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重印与许可
