Summary

تحديد حركية التشغيل في المختبر والخلوية لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري

Published: August 09, 2022
doi:

Summary

يقدم البروتوكول طريقتين لتحديد حركية أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري السبانخ2 والبروكلي. تصف الطريقة الأولى كيفية قياس حركية الأبتامير الفلورية في المختبر باستخدام قارئ الألواح ، بينما توضح الطريقة الثانية قياس حركية الأبتامير الفلورية في الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي.

Abstract

تم تطبيق أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري في الخلايا الحية لوضع علامة على الحمض النووي الريبي وتصوره ، والإبلاغ عن التعبير الجيني ، وتنشيط المستشعرات الحيوية الفلورية التي تكتشف مستويات المستقلبات وجزيئات الإشارة. من أجل دراسة التغيرات الديناميكية في كل من هذه الأنظمة ، من المستحسن الحصول على قياسات في الوقت الفعلي ، لكن دقة القياسات تعتمد على حركية التفاعل الفلوري أسرع من تردد أخذ العينات. هنا ، نصف طرق تحديد حركية التشغيل في المختبر والخلوية لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري باستخدام قارئ لوحة مجهز بحاقن عينة ومقياس تدفق خلوي ، على التوالي. لقد أظهرنا أن الحركية في المختبر لتنشيط التألق ل Spinach2 و Broccoli aptamers يمكن نمذجتها على أنها تفاعلات ارتباط ثنائية الطور ولها ثوابت معدل طور سريع مختلفة تبلغ 0.56 s−1 و 0.35 s−1 ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن الحركية الخلوية لتنشيط التألق للسبانخ2 في الإشريكية القولونية ، والتي يتم تقييدها بشكل أكبر بسبب انتشار الصبغة في البكتيريا سالبة الجرام ، لا تزال سريعة بما يكفي لتمكين تردد أخذ العينات بدقة على مقياس زمني دقيق. تنطبق هذه الطرق لتحليل حركية تنشيط التألق على أبتامات الحمض النووي الريبي الفلورية الأخرى التي تم تطويرها.

Introduction

التفاعلات الفلورية هي تفاعلات كيميائية تولد إشارة مضان. عادة ما تؤدي أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري هذه الوظيفة عن طريق ربط صبغة جزيء صغيرة لتعزيز عائدها الكمي الفلوري (الشكل 1 أ)1. تم تطوير أنظمة أبتامير RNA مختلفة الفلوروجين وتتكون من تسلسلات محددة من الحمض النووي الريبي أبتامير وروابط الصبغة المقابلة1. تم إلحاق أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري بنسخ الحمض النووي الريبي كعلامات فلورية تمكن من تصوير الخلايا الحية ل mRNAs و RNAs غير المشفرة2،3،4. كما تم وضعها بعد تسلسل المروج كمراسلين فلورسنت للتعبير الجيني ، على غرار استخدام بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) كمراسل ، باستثناء وظيفة الإبلاغ عند مستوى الحمض النووي الريبي 5,6. أخيرا ، تم دمج أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري في أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية القائمة على الحمض النووي الريبي ، والتي تم تصميمها لتحفيز التفاعل الفلوري استجابة لجزيء صغير معين. تم تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية القائمة على الحمض النووي الريبي لتصوير الخلايا الحية لمختلف المستقلبات غير الفلورية وجزيئات الإشارة7،8،9،10،11.

هناك اهتمام متزايد بتطوير أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري لتصور التغيرات الديناميكية في توطين الحمض النووي الريبي ، والتعبير الجيني ، وإشارات الجزيئات الصغيرة. لكل من هذه التطبيقات ، من المستحسن الحصول على قياسات في الوقت الفعلي ، لكن دقة القياسات تعتمد على حركية التفاعل الفلوري أسرع من تردد أخذ العينات. هنا ، نصف طرق تحديد حركية المختبر لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري السبانخ212 والبروكلي13 باستخدام قارئ لوحة مجهز بحاقن عينة ولتحديد حركية التشغيل الخلوي للسبانخ2 المعبر عنها في الإشريكية القولونية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تم اختيار هذين الأبتامير RNA لأنه تم تطبيقهما لدراسة توطين الحمض النووي الريبي2،3،4 ، وقد تم استخدامهما في المراسلين5،6 وأجهزة الاستشعار الحيوية7،8،9،10،11 ، وروابط الصبغة المقابلة (DFHBI أو DFHBI-1T) متاحة تجاريا. ويرد ملخص لخصائصها في المختبر المحددة في الأدبيات في الجدول 14،13،14 ، والذي أبلغ تطوير البروتوكول (على سبيل المثال ، الأطوال الموجية وتركيزات الصبغة المستخدمة). توضح هذه النتائج أن التفاعلات الفلورية المتأثرة بأبتامير الحمض النووي الريبي سريعة ويجب ألا تعيق القياسات الدقيقة للتطبيقات البيولوجية الخلوية المطلوبة.

Protocol

1. تجربة الحركية في المختبر إعداد قوالب الحمض النووي بواسطة PCRإعداد تفاعل (تفاعلات) تفاعل البوليميراز المتسلسل: لتحضير تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ادمج الكواشف التالية في أنبوب PCR رقيق الجدران:33 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج (ddH2O)10 ميكرولتر من …

Representative Results

الحركية في المختبريتم عرض تسلسل قوالب الحمض النووي والبادئات ، التي يتم شراؤها على شكل قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية ، في الجدول 2 ، ويتم عرض وصفات الكاشف في الملف التكميلي 1. يستخدم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لزيادة كمية قالب الحمض الن?…

Discussion

بالنسبة لتجربة الحركية في المختبر ، يمكن تعديل نفس البروتوكول العام لقياس الحركية في المختبر لجهاز استشعار حيوي فلوري قائم على الحمض النووي الريبي يحتوي على كل من مجال ربط الليجند وربط الفلوروفور8. في هذه الحالة ، يجب تحضين الحمض النووي الريبي مع الفلوروفور قبل الق?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية لصحة الأم والطفل: NSF-BSF 1815508 و NIH R01 GM124589. تم دعم MRM جزئيا من خلال منحة التدريب NIH T32 GM122740.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

References

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Play Video

Cite This Article
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

View Video