Isolatie van retinale pigmentepitheelcellen uit caviaogen
Summary
We beschrijven een eenvoudige en efficiënte methode voor het isoleren van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia’s. Deze procedure maakt follow-up moleculair biologisch onderzoek naar de geïsoleerde RPE mogelijk, inclusief genexpressieanalyses.
Abstract
Dit protocol beschrijft de isolatie van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia’s voor mogelijke toepassing in moleculair biologische studies, inclusief genexpressieanalyses. In de context van ooggroeiregulatie en bijziendheid speelt de RPE waarschijnlijk een rol als een cellulair relais voor groeimodulerende signalen, omdat het zich bevindt tussen het netvlies en de twee wanden van het oog, zoals het vaatvlies en sclera. Hoewel er protocollen voor het isoleren van de RPE zijn ontwikkeld voor zowel kuikens als muizen, zijn deze protocollen niet direct vertaalbaar gebleken naar de cavia, die een belangrijk en veel gebruikt zoogdierbijziendheidsmodel is geworden. In deze studie werden moleculaire biologische hulpmiddelen gebruikt om de expressie van specifieke genen te onderzoeken om te bevestigen dat de monsters vrij waren van besmetting van de aangrenzende weefsels. De waarde van dit protocol is al aangetoond in een RNA-Seq-studie van RPE van jonge gepigmenteerde cavia’s die zijn blootgesteld aan bijziendheid inducerende optische onscherpte. Naast ooggroeiregulatie heeft dit protocol andere potentiële toepassingen in studies van netvliesaandoeningen, waaronder myopische maculopathie, een van de belangrijkste oorzaken van blindheid bij myopes, waarbij de RPE betrokken is geweest. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig is en eenmaal geperfectioneerd, hoogwaardige RPE-monsters oplevert die geschikt zijn voor moleculair-biologische studies, waaronder RNA-analyse.
Introduction
De RPE bestaat uit een unieke monolaag van gepigmenteerde cellen tussen het neurale netvlies en het vasculaire vaatvlies, en de RPE heeft een goed erkende rol in de ontwikkeling en het onderhoud van de normale retinale functie, waaronder fototransductie 1,2. Meer recent heeft de RPE een extra sleutelrol gekregen in ooggroeiregulatie3 en daarmee de ontwikkeling van bijziendheid4. Deze toewijzing is gebaseerd op de kritische locatie van de RPE, tussen het netvlies en het vaatvlies en de inmiddels brede acceptatie dat ooggroei en dus refractiefouten lokaal worden gereguleerd5. De RPE wordt verondersteld een sleutelrol te spelen als een signaalrelais, dat het netvlies, de veronderstelde bron van groeimodulatorische signalen, verbindt met het vaatvlies en sclera, de twee doelen van de relaissignalen 6,7,8.
De toename van de axiale lengte die de meeste bijziendheid kenmerkt, kan niet als goedaardig worden beschouwd, waarbij pathofysiologische veranderingen met betrekking tot het netvlies, het vaatvlies en / of de sclera onvermijdelijke en nu algemeen erkende gevolgen van overmatige oculaire rek vertegenwoordigen 7,9. In deze context is de RPE misschien wel het meest kwetsbaar, omdat het, als niet-mitotisch weefsel, alleen in staat is om de uitdijende glasachtige kamer te accommoderen door het uitrekken en dunner worden van individuele cellen. Hoewel zijn rol in myopie-gerelateerde pathologieën, zoals myopische maculaire degeneratie, nog niet volledig is begrepen, is de RPE betrokken bij de pathogenese van een aantal andere retinale ziekten, waaronder geografische atrofie, een van de belangrijkste oorzaken van blindheid, die geassocieerd is met gedocumenteerde afwijkingen in het netvlies, RPE en vaathol10,11, 12.
De succesvolle isolatie van RPE-cellen, vrij van besmetting uit aangrenzende oogweefsels, opent mogelijk veel onderzoeksmogelijkheden om nieuwe inzichten te krijgen in de mechanismen die ten grondslag liggen aan een verscheidenheid aan oog- / netvliesaandoeningen. De isolatie van de RPE is echter een uitdaging gebleken, met veel gepubliceerde studies die om deze reden gebruik maken van gecombineerde retina / RPE- of RPE / choroide-monsters13,14,15. Studies met betrekking tot de succesvolle isolatie van de RPE van een kwaliteit die geschikt is voor moleculair biologisch onderzoek zijn beperkt tot kuiken- en muizenogen16,17. Bijvoorbeeld de simultane RPE-isolatie en RNA-stabilisatie (SRIRS) methode beschreven door Wang et al.18. Het isoleren van RPE-cellen bij muizen lijkt niet goed te werken in caviaogen. Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een verfijning van een aanpak die aanvankelijk door een van de auteurs (M.F.) met boomspitsmuisogen werd geprototypeerd en waarvan is bewezen dat het hoogwaardige RPE-monsters oplevert, geschikt voor RNA en andere moleculaire biologische analyses, uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia’s19.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we een methode voor het isoleren van RPE, geschikt voor RPE-genexpressieanalyses, uit de ogen van jonge, gepigmenteerde cavia’s. De verdiensten van dit protocol zijn dat het hoogwaardige RPE-monsters oplevert die relatief vrij zijn van verontreiniging, waarbij RNA op de juiste manier wordt bewaard voor RNA-specifieke analyses en toch relatief eenvoudig en efficiënt is. Terwijl in het hier gegeven voorbeeld de RPE-monsters werden verzameld uit de ogen van een jonge (2 weken oude) cavia, is het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), een Loris en David Rich Postdoctoral Scholar (S.G.), en een beurs van het National Eye Institute van de National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium – from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi – Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
