Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India
Summary
Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull’RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.
Abstract
Questo protocollo descrive l’isolamento delle cellule dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate per una potenziale applicazione negli studi di biologia molecolare, comprese le analisi di espressione genica. Nel contesto della regolazione della crescita oculare e della miopia, l’RPE svolge probabilmente un ruolo come relè cellulare per i segnali modulatori della crescita, poiché si trova tra la retina e le due pareti dell’occhio, come la coroide e la sclera. Mentre i protocolli per isolare l’RPE sono stati sviluppati sia per i pulcini che per i topi, questi protocolli hanno dimostrato di non essere direttamente traducibili nella cavia, che è diventata un modello di miopia di mammifero importante e ampiamente utilizzato. In questo studio, sono stati utilizzati strumenti di biologia molecolare per esaminare l’espressione di geni specifici per confermare che i campioni erano privi di contaminazione dai tessuti adiacenti. Il valore di questo protocollo è già stato dimostrato in uno studio RNA-Seq di RPE da giovani cavie pigmentate esposte a defocus ottico che induce miopia. Oltre alla regolazione della crescita oculare, questo protocollo ha altre potenziali applicazioni negli studi sulle malattie della retina, tra cui la maculopatia miopica, una delle principali cause di cecità nei miopi, in cui l’RPE è stato implicato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice e, una volta perfezionata, produce campioni RPE di alta qualità adatti per studi di biologia molecolare, compresa l’analisi dell’RNA.
Introduction
L’RPE comprende un monostrato unico di cellule pigmentate situate tra la retina neurale e la coroide vascolare e l’RPE ha ruoli ben noti nello sviluppo e nel mantenimento della normale funzione retinica, compresa la fototrasduzione 1,2. Più recentemente, all’RPE è stato assegnato un ulteriore ruolo chiave nella regolazione della crescita oculare3 e, quindi, nello sviluppo della miopia4. Questa assegnazione si basa sulla posizione critica dell’RPE, interposta tra la retina e la coroide e sull’ormai ampia accettazione che la crescita dell’occhio e, quindi, gli errori di rifrazione sono regolati localmente5. Si ritiene che l’RPE svolga un ruolo chiave come relè di segnale, collegando la retina, la presunta fonte di segnali modulatori della crescita, alla coroide e alla sclera, i due bersagli dei segnali trasmessi 6,7,8.
L’aumento della lunghezza assiale che caratterizza la maggior parte della miopia non può essere considerato benigno, con alterazioni fisiopatologiche che coinvolgono la retina, la coroide e/o la sclera che rappresentano conseguenze inevitabili e ormai ben riconosciute di un eccessivo allungamento oculare 7,9. In questo contesto, l’RPE è forse il più vulnerabile, poiché, essendo un tessuto non mitotico, è in grado di ospitare la camera vitreale in espansione solo attraverso lo stiramento e l’assottigliamento delle singole cellule. Mentre il suo ruolo nelle patologie correlate alla miopia, come la degenerazione maculare miopica, deve ancora essere completamente compreso, l’RPE è stato implicato nella patogenesi di una serie di altre malattie della retina, tra cui l’atrofia geografica, una delle principali cause di cecità, che è associata ad anomalie documentate nella retina, RPE e coroide10,11, 12.
Il successo dell’isolamento delle cellule RPE, libere dalla contaminazione dai tessuti oculari adiacenti, apre potenzialmente molte opportunità di ricerca per ottenere nuove informazioni sui meccanismi alla base di una varietà di malattie oculari / retiniche. Tuttavia, l’isolamento dell’RPE si è dimostrato impegnativo, con molti studi pubblicati che utilizzano campioni combinati di retina / RPE o RPE / coroide per questo motivo13,14,15. Gli studi che prevedono l’isolamento riuscito dell’RPE di una qualità adatta agli studi di biologia molecolare sono stati limitati agli occhi di pulcino e topo16,17. Ad esempio, il metodo simultaneo di isolamento RPE e stabilizzazione dell’RNA (SRIRS) descritto da Wang et al.18. Isolare le cellule RPE nei topi non sembra funzionare bene negli occhi delle cavie. Il protocollo qui descritto rappresenta un perfezionamento di un approccio che è stato inizialmente prototipato con occhi di toporagno degli alberi da uno degli autori (M.F.) e ha dimostrato di produrre campioni RPE di alta qualità, appropriati per l’RNA e altre analisi di biologia molecolare, dagli occhi di giovani cavie pigmentate19.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, descriviamo un metodo per isolare RPE, appropriato per le analisi di espressione genica RPE, dagli occhi di giovani cavie pigmentate. I meriti di questo protocollo sono che produce campioni RPE di alta qualità che sono relativamente privi di contaminazione, con RNA adeguatamente conservato per analisi specifiche dell’RNA e, tuttavia, è relativamente semplice ed efficiente. Mentre nell’esempio fornito qui, i campioni RPE sono stati raccolti dagli occhi di una cavia giovane (2 settimane), il protocoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), da un Loris and David Rich Postdoctoral Scholar (S.G.) e da una sovvenzione del National Eye Institute del National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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