Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia
Summary
Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.
Abstract
Este protocolo descreve o isolamento de células do epitélio pigmentado da retina (EPR) dos olhos de cobaias pigmentadas jovens para potencial aplicação em estudos de biologia molecular, incluindo análises de expressão gênica. No contexto da regulação do crescimento ocular e miopia, o EPR provavelmente desempenha um papel como um relé celular para sinais modulatórios de crescimento, uma vez que está localizado entre a retina e as duas paredes do olho, como a coroide e a esclera. Embora protocolos para isolar o PSE tenham sido desenvolvidos tanto para pintos quanto para camundongos, esses protocolos provaram não ser diretamente traduzíveis para a cobaia, que se tornou um modelo importante e amplamente utilizado de miopia em mamíferos. Neste estudo, ferramentas de biologia molecular foram usadas para examinar a expressão de genes específicos para confirmar que as amostras estavam livres de contaminação dos tecidos adjacentes. O valor desse protocolo já foi demonstrado em um estudo de RNA-Seq de PSE de cobaias pigmentadas jovens expostas ao desfoco óptico indutor de miopia. Além da regulação do crescimento ocular, esse protocolo tem outras aplicações potenciais em estudos de doenças retinianas, incluindo maculopatia míope, uma das principais causas de cegueira em miopes, na qual o EPR tem sido implicado. A principal vantagem desta técnica é que é relativamente simples e, uma vez aperfeiçoada, produz amostras de EPR de alta qualidade adequadas para estudos de biologia molecular, incluindo análise de RNA.
Introduction
O EPR compreende uma única monocamada de células pigmentadas localizada entre a retina neural e a coroide vascular, e o EPR tem papéis bem reconhecidos no desenvolvimento e manutenção da função normal da retina, incluindo a fototransdução 1,2. Mais recentemente, foi atribuído à PSE um papel fundamental adicional na regulação do crescimento ocular3 e, portanto, no desenvolvimento da miopia4. Essa atribuição baseia-se na localização crítica da PSE, interposta entre a retina e a coroide, e na aceitação agora ampla de que o crescimento ocular e, portanto, os erros refrativos são reguladoslocalmente5. Acredita-se que a PSE desempenhe um papel fundamental como relé de sinal, ligando a retina, fonte presumida de sinais modulatórios de crescimento, à coroide e esclera, os dois alvos dos sinais retransmitidos 6,7,8.
O aumento do comprimento axial que caracteriza a maioria das miopias não pode ser considerado benigno, com alterações fisiopatológicas envolvendo retina, coroide e/ou esclera representando consequências inevitáveis e agora bem reconhecidas doalongamento ocular excessivo7,9. Nesse contexto, o EPR talvez seja o mais vulnerável, pois, sendo um tecido não mitótico, só é capaz de acomodar a câmara vítrea em expansão pelo estiramento e afinamento de células individuais. Embora seu papel em patologias relacionadas à miopia, como a degeneração macular míope, ainda não seja totalmente compreendido, o EPR tem sido implicado na patogênese de uma série de outras doenças retinianas, incluindo a atrofia geográfica, uma das principais causas de cegueira, que está associada a anormalidades documentadas na retina, PSE e coroide10,11, 12º.
O isolamento bem-sucedido de células de EPR, livres de contaminação de tecidos oculares adjacentes, potencialmente abre muitas oportunidades de pesquisa para obter novos insights sobre os mecanismos subjacentes a uma variedade de doenças oculares/retinianas. Entretanto, o isolamento da PSE tem se mostrado desafiador, com muitos estudos publicados fazendo uso da combinação retina/PSE ou PSE/coroide por esse motivo13,14,15. Estudos envolvendo o sucesso do isolamento do EPR de qualidade adequada para estudos de biologia molecular têm sido limitados a olhos de pintinhos e camundongos16,17. Por exemplo, o método simultâneo de isolamento de PSE e estabilização de RNA (SRIRS) descrito por Wang et al.18. Isolar células RPE em camundongos não parece funcionar bem em olhos de cobaias. O protocolo aqui descrito representa um refinamento de uma abordagem que foi inicialmente prototipada com olhos de musaranho por um dos autores (M.F.) e provou produzir amostras de EPR de alta qualidade, apropriadas para análises de RNA e outras análises de biologia molecular, a partir de olhos de cobaias pigmentadasjovens19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, descrevemos um método de isolamento do EPR, apropriado para análises da expressão do gene do EPR, dos olhos de cobaias jovens e pigmentadas. O mérito deste protocolo é que ele produz amostras de EPR de alta qualidade que são relativamente livres de contaminação, com RNA adequadamente preservado para análises específicas de RNA e, ainda assim, é relativamente simples e eficiente. Enquanto no exemplo fornecido aqui, as amostras de EPR foram coletadas dos olhos de uma cobaia jovem (2 semanas de idad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência Bolsas de Pesquisa no Exterior (S.G.), um bolsista de pós-doutorado de Loris e David Rich (S.G.), e uma bolsa do Instituto Nacional de Olhos dos Institutos Nacionais de Saúde (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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