Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias
Summary
Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.
Abstract
Este protocolo describe el aislamiento de células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes para su posible aplicación en estudios de biología molecular, incluidos los análisis de expresión génica. En el contexto de la regulación del crecimiento ocular y la miopía, el EPR probablemente desempeña un papel como un relé celular para las señales moduladoras del crecimiento, ya que se encuentra entre la retina y las dos paredes del ojo, como la coroides y la esclerótica. Si bien se han desarrollado protocolos para aislar el EPR tanto para polluelos como para ratones, estos protocolos han demostrado no ser directamente traducibles al conejillo de indias, que se ha convertido en un modelo de miopía de mamíferos importante y ampliamente utilizado. En este estudio, se utilizaron herramientas de biología molecular para examinar la expresión de genes específicos para confirmar que las muestras estaban libres de contaminación de los tejidos adyacentes. El valor de este protocolo ya se ha demostrado en un estudio RNA-Seq de EPR de conejillos de indias pigmentados jóvenes expuestos a un desenfoque óptico inductor de miopía. Más allá de la regulación del crecimiento ocular, este protocolo tiene otras aplicaciones potenciales en estudios de enfermedades de la retina, incluida la maculopatía miópica, una de las principales causas de ceguera en miopes, en la que se ha implicado el EPR. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente simple y una vez perfeccionada, produce muestras de EPR de alta calidad adecuadas para estudios de biología molecular, incluido el análisis de ARN.
Introduction
El EPR comprende una monocapa única de células pigmentadas ubicadas entre la retina neural y la coroides vascular, y el EPR tiene funciones bien reconocidas en el desarrollo y mantenimiento de la función normal de la retina, incluida la fototransducción 1,2. Más recientemente, al EPR se le ha asignado un papel clave adicional en la regulación del crecimiento ocular3 y, por lo tanto, en el desarrollo de la miopía4. Esta asignación se basa en la ubicación crítica del EPR, interpuesta entre la retina y la coroides y la ahora amplia aceptación de que el crecimiento ocular y, por lo tanto, los errores refractivos están regulados localmente5. Se cree que el EPR desempeña un papel clave como relé de señal, vinculando la retina, la fuente asumida de señales moduladoras del crecimiento, con la coroides y la esclerótica, los dos objetivos de las señales transmitidas 6,7,8.
El aumento de la longitud axial que caracteriza a la mayoría de la miopía no puede considerarse benigno, con cambios fisiopatológicos que involucran retina, coroides y/o esclerótica que representan consecuencias inevitables y ahora bien reconocidas del alargamiento ocular excesivo 7,9. En este contexto, el EPR es quizás el más vulnerable, ya que, al ser un tejido no mitótico, solo puede acomodar la cámara vítrea en expansión mediante el estiramiento y adelgazamiento de células individuales. Si bien su papel en las patologías relacionadas con la miopía, como la degeneración macular miópica, aún no se comprende completamente, el EPR se ha implicado en la patogénesis de una serie de otras enfermedades de la retina, incluida la atrofia geográfica, una de las principales causas de ceguera, que se asocia con anomalías documentadas en la retina, el EPR y la coroides10,11, 12.
El aislamiento exitoso de las células del EPR, libres de contaminación de los tejidos oculares adyacentes, abre potencialmente muchas oportunidades de investigación para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a una variedad de enfermedades oculares / retinianas. Sin embargo, el aislamiento del EPR ha demostrado ser un desafío, con muchos estudios publicados que utilizan muestras combinadas de retina/EPR o EPR/coroides por esta razón13,14,15. Los estudios que implican el aislamiento exitoso del EPR de una calidad adecuada para estudios de biología molecular se han limitado a ojos de pollo y ratón16,17. Por ejemplo, el método simultáneo de aislamiento de EPR y estabilización de ARN (SRIRS) descrito por Wang et al.18. Aislar las células del EPR en ratones no parece funcionar bien en los ojos de conejillo de indias. El protocolo descrito aquí representa un refinamiento de un enfoque que fue inicialmente prototipado con ojos de musaraña de árbol por uno de los autores (M.F.) y ha demostrado producir muestras de EPR de alta calidad, apropiadas para ARN y otros análisis de biología molecular, de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes19.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, describimos un método para aislar el EPR, apropiado para los análisis de expresión génica del EPR, de los ojos de conejillos de indias jóvenes y pigmentados. Los méritos de este protocolo son que produce muestras de EPR de alta calidad que están relativamente libres de contaminación, con ARN adecuadamente preservado para análisis específicos de ARN y, sin embargo, es relativamente simple y eficiente. Mientras que en el ejemplo proporcionado aquí, las muestras de EPR se recolectaron de los oj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio cuenta con el apoyo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia en el Extranjero Research Fellowships (SG), un becario postdoctoral Loris y David Rich (SG), y una subvención del Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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