LPS و ATP الناجم عن موت البلاعم THP-1 المتمايزة PMA والتحقق من صحتها
Summary
يعتمد هذا البروتوكول على الموت الناجم عن LPS و ATP لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. نستخدم قياس التدفق الخلوي لتحليل التلوين المزدوج Annexin V و 7-AAD للكشف عن موت الخلايا ، باستخدام الخلية بأكملها واستخدام المجهر الإلكتروني الماسح لمراقبة مورفولوجيا غشاء الخلية.
Abstract
موت الخلايا هو عملية أساسية في جميع الكائنات الحية. ينشئ البروتوكول عديد السكاريد الشحمي (LPS) والأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الناجم عن ترسب الدهون المتمايز فوربول -12-ميريستات -13-أسيتات (PMA) في نموذج البلاعم البشرية (THP-1) لمراقبة موت الخلايا. LPS جنبا إلى جنب مع ATP هي طريقة تحريض التهابية كلاسيكية ، وغالبا ما تستخدم لدراسة pyroptosis ، ولكن موت الخلايا المبرمج و necroptosis تستجيب أيضا للتحفيز بواسطة LPS / ATP. في ظل الظروف العادية ، يتم توطين فوسفاتيديل سيرين فقط في النشرة الداخلية لغشاء البلازما. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، يظل غشاء الخلية سليما ويتعرض للفوسفاتيديل سيرين ، وفي المراحل اللاحقة ، يفقد غشاء الخلية سلامته. هنا ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل تلطيخ Annexin V و 7-Aminoactinomycin D (AAD) للكشف عن موت الخلايا من الخلايا بأكملها. تظهر النتائج أن الخلايا الكبيرة ماتت بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، نلاحظ الأشكال المحتملة لموت الخلايا في الخلايا الفردية. تشير النتائج إلى أن الخلايا قد تخضع لداء البروبتيس أو موت الخلايا المبرمج أو التنخر بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. يركز هذا البروتوكول على مراقبة موت الضامة بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. أظهرت النتائج أن موت الخلايا بعد تحفيز LPS و ATP لا يقتصر على pyroptosis وأن موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا المبرمج الناخر يمكن أن يحدث أيضا ، مما يساعد الباحثين على فهم موت الخلايا بشكل أفضل بعد تحفيز LPS و ATP واختيار طريقة تجريبية أفضل.
Introduction
موت الخلايا هو عملية فسيولوجية أساسية في جميع الكائنات الحية. في السنوات الأخيرة ، أظهرت دراسات جوهرية أن موت الخلايا يشارك في المناعة والتوازن داخل الكائن الحي. تساعدنا دراسة موت الخلايا على فهم ظهور الأمراض وتطورها بشكل أفضل. تم وصف عدة أشكال من موت الخلايا المبرمج ، وتم تحديد بعض الأهداف الرئيسية في هذه العمليات. Pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis هي مسارات موت الخلايا الثلاثة المبرمجة المحددة وراثيا والتي تشارك في التوازن الداخلي والمرض1.
يتميز Pyroptosis بتكوين مسام الغشاء وإطلاق محتويات الخلية. تشق الكاسباز أو الجرانزيمات المنشطة gasdermins لفصل مجالاتها الطرفية N ، والتي تقوم بعد ذلك بتكوين oligomerize ، وترتبط بالغشاء ، وتشكل المسام2،3،4. توفر مسام gasdermin قناة إفراز غير نمطية عبر الأغشية الخلوية ، مما يؤدي إلى استجابات الخلايا النهائية ، بما في ذلك إطلاق المحتوى وتدفق الأيونات2،3،4. في النهاية ، تعاني الخلايا في النهاية من تمزق غشاء البلازما وتحلل الحمم البركانية الذي يسهله النينجورين -15. في موت الخلايا المبرمج ، يشكل Bax و Bak المنشطان أوليغومرات على الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ويطلقان السيتوكروم C ، الذي ينظمه التوازن بين البروتينات proapoptotic و antiapoptotic من عائلة BCL-2 ، caspases البادئ (caspase-8 ، -9 و -10) و caspases المستجيب (caspase-3 و -6 و -7) 1،6،7. تشمل التغيرات المورفولوجية لموت الخلايا المبرمج نفخ الغشاء ، وانكماش الخلايا ، والتجزئة النووية ، وتكثيف الكروماتين ، وتكوين الجسم المبرمج 6,8. إن كيناز بروتين سيرين / ثريونين المتفاعل مع المستقبلات 1 (RIPK3) ومجال كيناز مختلط السلالة (MLKL) هما مكونان أساسيان في المصب للآلية الميتة1. يقوم RIPK3 بتجنيد وفسفرة MLKL ، و p-MLKL oligomerizes ، ويرتبط بغشاء الخلية ، ويبدأ ثقوب الغشاء ، ويسبب تدفق الأيونات ، ويزيد من الأسمولية داخل الخلايا ، وفي النهاية تمزق الخلية 6,9. يرتبط Gasdermins و MLKL بغشاء البلازما ويتوسطان pyroptosis و necroptosis ، على التوالي ، بينما يتوسط BAX / BAK موت الخلايا المبرمج عن طريق الارتباط بالغشاء الخارجي للميتوكوندريا6.
على الرغم من أن كل مسار له آليات ونتائج محددة ، إلا أنها تؤدي إلى تغييرات مماثلة على غشاء الخلية. في ظل الظروف العادية ، يتم توطين فوسفاتيديل سيرين (PS) فقط في النشرة الداخلية لغشاء البلازما. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، سيتم الكشف عن PS ، خارج غشاء البلازما. ينشط Caspase-3 / caspase-7 عائلات TMEM16 و XKR ، مما يؤدي إلى غشاء خلوي غير متماثل ويخرج PS أثناء موت الخلايا المبرمج10. يؤدي تدفق Gasdermin D بوساطة و MLKL بوساطةCa 2+ إلى فقدان تناسق طبقة الفوسفوليبيد المزدوجة على غشاء الخلية والتعرض ل PS. يحدث التعرض قبل فقدان سلامة غشاء الخلية11,12. بناء على التغييرات المماثلة في غشاء هذه الأنواع الثلاثة من موت الخلايا المبرمج ، نستخدم قياس التدفق الخلوي لتحليل التلوين المزدوج Annexin V / 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) للكشف عن موت الخلايا. يحتوي Annexin V ، وهو بروتين مرتبط بالفوسفوليبيد يعتمد على الكالسيوم ، على تقارب كبير مع PS ، والذي يمكن أن يكون بمثابة مسبار حساس للكشف عن PS المكشوف على سطح غشاء البلازما13. 7-AAD هي بقعة حمض نووي لا يمكنها المرور عبر غشاء الخلية بأكمله. إنه مشابه ليوديد البروبيديوم (PI) ، صبغة حمض نووي شائعة الاستخدام. لديهم خصائص مضان مماثلة ، ولكن 7-AAD لديه طيف انبعاث أضيق وتداخل أقل مع قنوات الكشف الأخرى. بسبب أوجه التشابه هذه ، لا يكفي التمييز بين داء البيروبتوسيس ، موت الخلايا المبرمج ، والتنخر. استخدمنا قياس التدفق الخلوي للكشف عن موت الخلايا من الخلايا الكاملة. يتم استخدام طريقة ثانية لالتقاط غشاء الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لمراقبة الأشكال المحتملة لموت الخلايا في الخلايا الفردية.
أنشأنا عديد السكاريد الدهني (LPS) وأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الناجم عن ترسب الدهون المتمايز فوربول -12-ميريستات -13-أسيتات (PMA) في نموذج البلاعم البشرية (THP-1) لمراقبة موت الخلايا. يركز هذا البروتوكول على مراقبة موت الخلايا بدلا من التحقيق في الآليات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، تم استخدام طريقتين للكشف عن LPS والموت الناجم عن ATP لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. تم استخدام التلوين المزدوج الملحق V / 7-AAD ، وتم تحليل النتائج بواسطة قياس التدفق الخلوي من التلوين الكلي. كما هو الحال مع تحليل التدفق الخلوي الآخر ، تم إنشاء مجموعة من الخلايا غير الملوثة ومجموعتين م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعرب عن تقديرنا الكبير لجيايي سون ولو يانغ في المعهد المبتكر للطب الصيني والصيدلة ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، للمساعدة في قياس التدفق الخلوي ، Cuiping Chen في مختبر الدولة الرئيسي لموارد الطب الصيني الجنوبي الغربي ، للمساعدة في المسح المجهري الإلكتروني. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [82104491] ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في سيتشوان [2023NSFSC0674] ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه في الصين [2021M693789].
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
References
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
- Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
- Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
- Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
- Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
- Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
- Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
- Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
- Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
- Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
- JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
- Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
- Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
- Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
- Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
- Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
- Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
- Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
- Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
- Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
- Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
- Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
- Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
- Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).
