PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu
Summary
Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP’ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.
Abstract
Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir süreçtir. Protokol, hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenosin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturur. ATP ile kombine LPS, genellikle piroptozu incelemek için kullanılan klasik bir inflamatuar indüksiyon yöntemidir, ancak apoptoz ve nekrotoz da LPS / ATP ile stimülasyona yanıt verir. Normal şartlar altında, fosfatidilserin sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken aşamalarında, hücre zarı bozulmadan kalır ve fosfatidilserine maruz kalır ve sonraki aşamalarda hücre zarı bütünlüğünü kaybeder. Burada, tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-Aminoaktinomisin D (AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıldı. Sonuçlar, LPS / ATP ile stimülasyondan sonra önemli hücrelerin öldüğünü göstermektedir. Taramalı elektron mikroskobu kullanarak, tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemliyoruz. Sonuçlar, hücrelerin LPS / ATP ile stimülasyondan sonra piroptoz, apoptoz veya nekrotoz geçirebileceğini göstermektedir. Bu protokol, LPS/ATP ile stimülasyondan sonra makrofajların ölümünü gözlemlemeye odaklanır. Sonuçlar, LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünün piroptoz ile sınırlı olmadığını ve apoptoz ve nekrotik apoptozun da meydana gelebileceğini gösterdi, bu da araştırmacıların LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünü daha iyi anlamalarına ve daha iyi bir deneysel yöntem seçmelerine yardımcı oldu.
Introduction
Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir fizyolojik süreçtir. Son yıllarda, önemli çalışmalar, hücre ölümünün organizma içindeki bağışıklık ve dengede rol oynadığını göstermiştir. Hücre ölümünü incelemek, hastalıkların başlangıcını ve gelişimini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Programlanmış hücre ölümünün çeşitli biçimleri tanımlanmış ve bu süreçlerdeki bazı kilit hedefler tanımlanmıştır. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotoz, iç denge ve hastalık1’de yer alan genetik olarak tanımlanmış üç programlanmış hücre ölümü yoludur.
Piraktoz, zar gözeneklerinin oluşumu ve hücre içeriğinin salınması ile karakterizedir. Aktive edilmiş kaspazlar veya granzimler, daha sonra oligomerleşen, zara bağlanan ve gözenekleri 2,3,4 oluşturan N-terminal alanlarını ayırmak için gasderminleri parçalar. Gasdermin gözeneği, hücresel zarlar boyunca atipik bir salgı kanalı sağlar, bu da içerik salınımı ve iyon akışı 2,3,4 dahil olmak üzere aşağı akış hücre tepkilerine neden olur. Sonuçta, hücreler sonunda ninjurin-15 tarafından kolaylaştırılan plazma zarı yırtılması ve piroptotik lizis yaşarlar. Apoptozda, aktive edilmiş Bax ve Bak, mitokondriyal dış zar üzerinde oligomerler oluşturur ve BCL-2 ailesinin proapoptotik ve antiapoptotik proteinleri, başlatıcı kaspazlar (kaspaz-8, -9 ve -10) ve efektör kaspazlar (kaspaz-3, -6 ve -7) arasındaki denge ile düzenlenen sitokrom C’yi serbest bırakır1,6,7. Apoptozun morfolojik değişiklikleri arasında membran kanaması, hücre büzülmesi, nükleer parçalanma, kromatin yoğunlaşması ve apoptotik cisim oluşumubulunur 6,8. Reseptör etkileşimli serin / treonin-protein kinaz 1 (RIPK3) ve karışık soy kinaz alanı benzeri (MLKL), nekrototik mekanizma1’in iki aşağı akış çekirdek bileşenidir. RIPK3 MLKL’yi işe alır ve fosforile eder, p-MLKL oligomerize eder, hücre zarı ile birleşir, zar deliklerini başlatır, iyon akışına neden olur, hücre içi ozmolariteyi arttırır ve sonunda hücre yırtılması 6,9. Gasdermins ve MLKL plazma zarına bağlanır ve sırasıyla piroptoz ve nekrotoza aracılık ederken, BAX/BAK mitokondri6’nın dış zarına bağlanarak apoptoza aracılık eder.
Her yolun kendine özgü mekanizmaları ve sonuçları olmasına rağmen, hücre zarında benzer değişikliklere yol açarlar. Normal şartlar altında, fosfatidilserin (PS) sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS plazma zarının dışında açığa çıkacaktır. Kaspaz-3 / kaspaz-7, asimetrik bir hücre zarına yol açan ve apoptoz10 sırasında PS’yi dışsallaştıran TMEM16 ve XKR ailelerini aktive eder. Gasdermin D aracılı ve MLKL aracılı Ca2 + akışı, hücre zarı üzerindeki fosfolipid çift tabakasının simetrisinin kaybına ve PS’nin maruz kalmasına yol açar. Maruziyet, hücre zarı bütünlüğünün kaybından önce gerçekleşir11,12. Bu üç tip programlanmış hücre ölümünün zarındaki benzer değişikliklere dayanarak, hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V / 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz. Kalsiyuma bağımlı bir fosfolipid bağlayıcı protein olan Annexin V, plazma zarının13 yüzeyinde açıkta kalan PS’yi tespit etmek için hassas bir prob görevi görebilen PS için yüksek bir afiniteye sahiptir. 7-AAD, tüm hücre zarından geçemeyen bir nükleik asit lekesidir. Yaygın olarak kullanılan bir nükleik asit boyası olan propidyum iyodür (PI) ile benzerdir. Benzer floresan özelliklerine sahiptirler, ancak 7-AAD daha dar bir emisyon spektrumuna ve diğer algılama kanallarıyla daha az parazite sahiptir. Bu benzerlikler nedeniyle piroptoz, apoptoz ve nekrotoz arasında ayrım yapmak yeterli değildir. Tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için akış sitometrisi kullandık. Tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak hücre zarını yakalamak için ikinci bir yöntem kullanılır.
Hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenozin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturduk. Bu protokol, mekanizmaları araştırmaktan ziyade hücre ölümünü gözlemlemeye odaklanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP’ye bağlı ölümünü saptamak için iki yöntem kullanılmıştır. Annexin V/7-AAD çift boyama kullanıldı ve sonuçlar genel boyamadan akış sitometrisi ile analiz edildi. Diğer akış sitometrik analizlerinde olduğu gibi, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçları dışlamak için bir grup boyanmamış hücre ve iki grup tek boyanmış hücre kuruldu. Sonuçlar, LPS / ATP stimülasyonundan sonra, birkaç hücrenin zar bütünlüğün?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, Yenilikçi Çin Tıbbı ve Eczacılık Enstitüsü’nden Jiayi Sun ve Lu Yang’a, akış sitometrisi konusunda yardım için, Güneybatı Çin Tıbbı Kaynakları Devlet Anahtar Laboratuvarı’nda Cuiping Chen’e, taramalı elektron mikroskobu konusunda yardım için büyük takdirimizi sunuyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [82104491], Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı [2023NSFSC0674] ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı [2021M693789] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
References
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
- Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
- Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
- Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
- Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
- Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
- Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
- Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
- Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
- Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
- JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
- Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
- Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
- Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
- Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
- Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
- Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
- Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
- Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
- Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
- Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
- Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
- Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
- Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).
