LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione
Summary
Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l’annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l’intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.
Abstract
La morte cellulare è un processo fondamentale in tutti gli organismi viventi. Il protocollo stabilisce una deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. L’LPS combinato con l’ATP è un classico metodo di induzione infiammatoria, spesso utilizzato per studiare la piroptosi, ma anche l’apoptosi e la necroptosi rispondono alla stimolazione da parte di LPS/ATP. In circostanze normali, la fosfatidilserina è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell’apoptosi e della necroptosi, la membrana cellulare rimane intatta ed esposta alla fosfatidilserina e, nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità. Qui, la citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la doppia colorazione dell’annessina V e della 7-amminoattinomicina D (AAD) per rilevare la morte cellulare da intere cellule. I risultati mostrano che le cellule sostanziali sono morte dopo la stimolazione con LPS/ATP. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, osserviamo le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule. I risultati indicano che le cellule possono andare incontro a piroptosi, apoptosi o necroptosi dopo la stimolazione con LPS/ATP. Questo protocollo si concentra sull’osservazione della morte dei macrofagi dopo la stimolazione con LPS/ATP. I risultati hanno mostrato che la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP non si limita alla piroptosi e che possono verificarsi anche apoptosi e apoptosi necrotica, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore.
Introduction
La morte cellulare è un processo fisiologico fondamentale in tutti gli organismi viventi. Negli ultimi anni, studi sostanziali hanno dimostrato che la morte cellulare è coinvolta nell’immunità e nell’equilibrio all’interno dell’organismo. Studiare la morte cellulare ci aiuta a comprendere meglio l’insorgenza e lo sviluppo delle malattie. Sono state descritte diverse forme di morte cellulare programmata e sono stati identificati alcuni bersagli chiave in questi processi. La piroptosi, l’apoptosi e la necroptosi sono le tre vie di morte cellulare programmata geneticamente definite coinvolte nell’equilibrio interno e nella malattia1.
La piroptosi è caratterizzata dalla formazione di pori di membrana e dal rilascio di contenuto cellulare. Le caspasi attivate o granzimi scindono le gasdermine per separare i loro domini N-terminali, che poi oligomerizzano, si legano alla membrana e formano pori 2,3,4. Il poro di gasdermin fornisce un canale di secrezione atipico attraverso le membrane cellulari, con conseguente risposta cellulare a valle, tra cui il rilascio di contenuto e l’afflusso di ioni 2,3,4. Alla fine, le cellule alla fine subiscono la rottura della membrana plasmatica e la lisi piptotica facilitata dalla ninferina-15. Nell’apoptosi, Bax e Bak attivati formano oligomeri sulla membrana esterna mitocondriale e rilasciano citocromo C, che è regolato da un equilibrio tra proteine proapoptotiche e antiapoptotiche della famiglia BCL-2, caspasi iniziatrici (caspasi-8, -9 e -10) e caspasi effettrici (caspasi-3, -6 e -7)1,6,7. I cambiamenti morfologici dell’apoptosi includono il blebbing della membrana, il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare, la condensazione della cromatina e la formazione di corpi apoptotici 6,8. La serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK3) che interagisce con il recettore e il dominio chinasi a linea mista (MLKL) sono due componenti fondamentali a valle del meccanismo necroptotico1. RIPK3 recluta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomerizza, si associa con la membrana cellulare, avvia perforazioni di membrana, provoca afflusso di ioni, aumenta l’osmolarità intracellulare e infine la rottura cellulare 6,9. Gasdermins e MLKL si legano alla membrana plasmatica e mediano rispettivamente la piroptosi e la necroptosi, mentre BAX/BAK media l’apoptosi legandosi alla membrana esterna dei mitocondri6.
Sebbene ogni percorso abbia meccanismi ed esiti specifici, portano a cambiamenti simili sulla membrana cellulare. In circostanze normali, la fosfatidilserina (PS) è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell’apoptosi e della necroptosi, il PS sarà esposto, al di fuori della membrana plasmatica. La caspasi-3/caspasi-7 attiva le famiglie TMEM16 e XKR, che porta a una membrana cellulare asimmetrica ed esternalizza il PS durante l’apoptosi10. L’afflusso di Ca2+ mediato da Gasdermin D e MLKL porta alla perdita della simmetria del doppio strato fosfolipidico sulla membrana cellulare e all’esposizione di PS. L’esposizione avviene prima della perdita dell’integrità della membrana cellulare11,12. Sulla base dei cambiamenti simili nella membrana di questi tre tipi di morte cellulare programmata, utilizziamo la citometria a flusso per analizzare la doppia colorazione dell’annessina V/7-amminoactinomicina D (7-AAD) per rilevare la morte cellulare. L’annessina V, una proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, ha un’elevata affinità per la PS, che può fungere da sonda sensibile per rilevare la PS esposta sulla superficie della membrana plasmatica13. Il 7-AAD è una colorazione di acido nucleico che non può passare attraverso l’intera membrana cellulare. È simile allo ioduro di propidio (PI), un colorante di acidi nucleici comunemente usato. Hanno caratteristiche di fluorescenza simili, ma 7-AAD ha uno spettro di emissione più ristretto e meno interferenze con altri canali di rivelazione. A causa di queste somiglianze, non è sufficiente distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Abbiamo usato la citometria a flusso per rilevare la morte cellulare da cellule intere. Un secondo metodo viene utilizzato per catturare la membrana cellulare utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) per osservare le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule.
Abbiamo stabilito un modello di deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. Questo protocollo si concentra sull’osservazione della morte cellulare piuttosto che sullo studio dei meccanismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, sono stati utilizzati due metodi per rilevare LPS e la morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. È stata utilizzata la doppia colorazione con annessina V/7-AAD e i risultati sono stati analizzati mediante citometria a flusso dalla colorazione complessiva. Come per altre analisi citofluorimetriche, un gruppo di cellule non colorate e due gruppi di cellule colorate singolarmente sono stati impostati per escludere risultati falsi positivi e falsi negativi. I risultati mostrano ch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun e Lu Yang dell’Istituto Innovativo di Medicina Cinese e Farmacia, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l’assistenza con la citometria a flusso, Cuiping Chen del Laboratorio chiave statale delle risorse di medicina cinese sudoccidentale, per l’aiuto con la microscopia elettronica a scansione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [82104491], dalla Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] e dalla Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789].
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
References
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