Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l’annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l’intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.
La morte cellulare è un processo fondamentale in tutti gli organismi viventi. Il protocollo stabilisce una deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. L’LPS combinato con l’ATP è un classico metodo di induzione infiammatoria, spesso utilizzato per studiare la piroptosi, ma anche l’apoptosi e la necroptosi rispondono alla stimolazione da parte di LPS/ATP. In circostanze normali, la fosfatidilserina è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell’apoptosi e della necroptosi, la membrana cellulare rimane intatta ed esposta alla fosfatidilserina e, nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità. Qui, la citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la doppia colorazione dell’annessina V e della 7-amminoattinomicina D (AAD) per rilevare la morte cellulare da intere cellule. I risultati mostrano che le cellule sostanziali sono morte dopo la stimolazione con LPS/ATP. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, osserviamo le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule. I risultati indicano che le cellule possono andare incontro a piroptosi, apoptosi o necroptosi dopo la stimolazione con LPS/ATP. Questo protocollo si concentra sull’osservazione della morte dei macrofagi dopo la stimolazione con LPS/ATP. I risultati hanno mostrato che la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP non si limita alla piroptosi e che possono verificarsi anche apoptosi e apoptosi necrotica, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore.
La morte cellulare è un processo fisiologico fondamentale in tutti gli organismi viventi. Negli ultimi anni, studi sostanziali hanno dimostrato che la morte cellulare è coinvolta nell’immunità e nell’equilibrio all’interno dell’organismo. Studiare la morte cellulare ci aiuta a comprendere meglio l’insorgenza e lo sviluppo delle malattie. Sono state descritte diverse forme di morte cellulare programmata e sono stati identificati alcuni bersagli chiave in questi processi. La piroptosi, l’apoptosi e la necroptosi sono le tre vie di morte cellulare programmata geneticamente definite coinvolte nell’equilibrio interno e nella malattia1.
La piroptosi è caratterizzata dalla formazione di pori di membrana e dal rilascio di contenuto cellulare. Le caspasi attivate o granzimi scindono le gasdermine per separare i loro domini N-terminali, che poi oligomerizzano, si legano alla membrana e formano pori 2,3,4. Il poro di gasdermin fornisce un canale di secrezione atipico attraverso le membrane cellulari, con conseguente risposta cellulare a valle, tra cui il rilascio di contenuto e l’afflusso di ioni 2,3,4. Alla fine, le cellule alla fine subiscono la rottura della membrana plasmatica e la lisi piptotica facilitata dalla ninferina-15. Nell’apoptosi, Bax e Bak attivati formano oligomeri sulla membrana esterna mitocondriale e rilasciano citocromo C, che è regolato da un equilibrio tra proteine proapoptotiche e antiapoptotiche della famiglia BCL-2, caspasi iniziatrici (caspasi-8, -9 e -10) e caspasi effettrici (caspasi-3, -6 e -7)1,6,7. I cambiamenti morfologici dell’apoptosi includono il blebbing della membrana, il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare, la condensazione della cromatina e la formazione di corpi apoptotici 6,8. La serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK3) che interagisce con il recettore e il dominio chinasi a linea mista (MLKL) sono due componenti fondamentali a valle del meccanismo necroptotico1. RIPK3 recluta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomerizza, si associa con la membrana cellulare, avvia perforazioni di membrana, provoca afflusso di ioni, aumenta l’osmolarità intracellulare e infine la rottura cellulare 6,9. Gasdermins e MLKL si legano alla membrana plasmatica e mediano rispettivamente la piroptosi e la necroptosi, mentre BAX/BAK media l’apoptosi legandosi alla membrana esterna dei mitocondri6.
Sebbene ogni percorso abbia meccanismi ed esiti specifici, portano a cambiamenti simili sulla membrana cellulare. In circostanze normali, la fosfatidilserina (PS) è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell’apoptosi e della necroptosi, il PS sarà esposto, al di fuori della membrana plasmatica. La caspasi-3/caspasi-7 attiva le famiglie TMEM16 e XKR, che porta a una membrana cellulare asimmetrica ed esternalizza il PS durante l’apoptosi10. L’afflusso di Ca2+ mediato da Gasdermin D e MLKL porta alla perdita della simmetria del doppio strato fosfolipidico sulla membrana cellulare e all’esposizione di PS. L’esposizione avviene prima della perdita dell’integrità della membrana cellulare11,12. Sulla base dei cambiamenti simili nella membrana di questi tre tipi di morte cellulare programmata, utilizziamo la citometria a flusso per analizzare la doppia colorazione dell’annessina V/7-amminoactinomicina D (7-AAD) per rilevare la morte cellulare. L’annessina V, una proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, ha un’elevata affinità per la PS, che può fungere da sonda sensibile per rilevare la PS esposta sulla superficie della membrana plasmatica13. Il 7-AAD è una colorazione di acido nucleico che non può passare attraverso l’intera membrana cellulare. È simile allo ioduro di propidio (PI), un colorante di acidi nucleici comunemente usato. Hanno caratteristiche di fluorescenza simili, ma 7-AAD ha uno spettro di emissione più ristretto e meno interferenze con altri canali di rivelazione. A causa di queste somiglianze, non è sufficiente distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Abbiamo usato la citometria a flusso per rilevare la morte cellulare da cellule intere. Un secondo metodo viene utilizzato per catturare la membrana cellulare utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) per osservare le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule.
Abbiamo stabilito un modello di deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. Questo protocollo si concentra sull’osservazione della morte cellulare piuttosto che sullo studio dei meccanismi.
In questo manoscritto, sono stati utilizzati due metodi per rilevare LPS e la morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. È stata utilizzata la doppia colorazione con annessina V/7-AAD e i risultati sono stati analizzati mediante citometria a flusso dalla colorazione complessiva. Come per altre analisi citofluorimetriche, un gruppo di cellule non colorate e due gruppi di cellule colorate singolarmente sono stati impostati per escludere risultati falsi positivi e falsi negativi. I risultati mostrano ch…
The authors have nothing to disclose.
Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun e Lu Yang dell’Istituto Innovativo di Medicina Cinese e Farmacia, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l’assistenza con la citometria a flusso, Cuiping Chen del Laboratorio chiave statale delle risorse di medicina cinese sudoccidentale, per l’aiuto con la microscopia elettronica a scansione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [82104491], dalla Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] e dalla Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789].
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto ![]() |
|
flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |