Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación
Summary
Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.
Abstract
La muerte celular es un proceso fundamental en todos los organismos vivos. El protocolo establece un modelo de lipídico diferenciado por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. El LPS combinado con ATP es un método clásico de inducción inflamatoria, a menudo utilizado para estudiar la piroptosis, pero la apoptosis y la necroptosis también responden a la estimulación por LPS/ATP. En circunstancias normales, la fosfatidilserina solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la membrana celular permanece intacta y expuesta a la fosfatidilserina, y en las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad. En este caso, se utilizó citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-aminoactinomicina D (AAD) para detectar la muerte celular de las células enteras. Los resultados muestran que células sustanciales murieron después de la estimulación con LPS/ATP. Utilizando microscopía electrónica de barrido, observamos las posibles formas de muerte celular en células individuales. Los resultados indican que las células pueden sufrir piroptosis, apoptosis o necroptosis después de la estimulación con LPS/ATP. Este protocolo se centra en observar la muerte de los macrófagos tras la estimulación con LPS/ATP. Los resultados mostraron que la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP no se limita a la piroptosis y que también pueden ocurrir apoptosis y apoptosis necróticas, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP y elegir un mejor método experimental.
Introduction
La muerte celular es un proceso fisiológico fundamental en todos los organismos vivos. En los últimos años, estudios sustanciales han demostrado que la muerte celular está involucrada en la inmunidad y el equilibrio dentro del organismo. El estudio de la muerte celular nos ayuda a comprender mejor la aparición y el desarrollo de las enfermedades. Se han descrito varias formas de muerte celular programada y se han identificado algunos objetivos clave en estos procesos. La piroptosis, la apoptosis y la necroptosis son las tres vías de muerte celular programada genéticamente definidas que participan en el equilibrio interno yla enfermedad.
La piroptosis se caracteriza por la formación de poros en la membrana y la liberación de contenido celular. Las caspasas o granzimas activadas escinden las gasderminas para separar sus dominios N-terminales, que luego se oligomerizan, se unen a la membrana y forman poros 2,3,4. El poro de gasdermina proporciona un canal de secreción atípico a través de las membranas celulares, lo que da lugar a respuestas celulares posteriores, incluida la liberación de contenido y la afluencia de iones 2,3,4. En última instancia, las células finalmente experimentan la ruptura de la membrana plasmática y la lisis piroptótica facilitada por la ninjurina-15. En la apoptosis, Bax y Bak activados forman oligómeros en la membrana externa mitocondrial y liberan citocromo C, que está regulado por un equilibrio entre proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas de la familia BCL-2, caspasas iniciadoras (caspasas-8, -9 y -10) y caspasas efectoras (caspasas-3, -6 y -7)1,6,7. Los cambios morfológicos de la apoptosis incluyen la formación de ampollas en la membrana, la contracción celular, la fragmentación nuclear, la condensación de la cromatina y la formación de cuerpos apoptóticos 6,8. La serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK3) que interactúa con el receptor y el dominio similar a la quinasa de linaje mixto (MLKL) son dos componentes centrales del mecanismo necroptótico1. RIPK3 recluta y fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, se asocia con la membrana celular, inicia perforaciones de membrana, causa afluencia de iones, aumenta la osmolaridad intracelular y, finalmente, la ruptura celular 6,9. Las gasderminas y MLKL se unen a la membrana plasmática y median la piroptosis y la necroptosis, respectivamente, mientras que BAX/BAK media la apoptosis al unirse a la membrana externa de las mitocondrias6.
Aunque cada vía tiene mecanismos y resultados específicos, conducen a cambios similares en la membrana celular. En circunstancias normales, la fosfatidilserina (PS) solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estará expuesta, fuera de la membrana plasmática. La caspasa-3/caspasa-7 activa las familias TMEM16 y XKR, lo que conduce a una membrana celular asimétrica y externaliza la PS durante la apoptosis10. La afluencia de Ca2+ mediada por Gasdermin D y MLKL conduce a la pérdida de la simetría de la bicapa de fosfolípidos en la membrana celular y a la exposición de PS. La exposición ocurre antes de la pérdida de la integridad de la membrana celular11,12. Sobre la base de los cambios similares en la membrana de estos tres tipos de muerte celular programada, utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de la anexina V/7-aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar la muerte celular. La anexina V, una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio, tiene una alta afinidad por la PS, que puede servir como una sonda sensible para detectar la PS expuesta en la superficie de la membrana plasmática13. El 7-AAD es una tinción de ácido nucleico que no puede atravesar toda la membrana celular. Es similar al yoduro de propidio (PI), un colorante de ácido nucleico comúnmente utilizado. Tienen características de fluorescencia similares, pero el 7-AAD tiene un espectro de emisión más estrecho y menos interferencia con otros canales de detección. Debido a estas similitudes, no es suficiente distinguir entre piroptosis, apoptosis y necroptosis. Utilizamos la citometría de flujo para detectar la muerte celular de células enteras. Un segundo método se utiliza para capturar la membrana celular mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para observar las posibles formas de muerte celular en células individuales.
Establecimos un modelo de macrófagos diferenciados por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. Este protocolo se centra en la observación de la muerte celular más que en la investigación de los mecanismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se utilizaron dos métodos para detectar la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Se utilizó la tinción doble con anexina V/7-AAD y los resultados se analizaron mediante citometría de flujo a partir de la tinción general. Al igual que con otros análisis de citometría de flujo, se configuró un grupo de células sin tinción y dos grupos de células con una sola tinción para excluir los resultados falsos positivos y falsos negativos. Los resultados muestran qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expresamos nuestro gran agradecimiento a Jiayi Sun y Lu Yang del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, por la asistencia con la citometría de flujo, a Cuiping Chen del Laboratorio Estatal Clave de Recursos de Medicina del Suroeste de China, por la ayuda con la microscopía electrónica de barrido. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [82104491], la Fundación de Ciencias Naturales de Sichuan [2023NSFSC0674] y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China [2021M693789].
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
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