Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation
Summary
Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.
Abstract
La mort cellulaire est un processus fondamental dans tous les organismes vivants. Le protocole établit un modèle de dépôt lipidique différencié du phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Le LPS combiné à l’ATP est une méthode d’induction inflammatoire classique, souvent utilisée pour étudier la pyroptose, mais l’apoptose et la nécroptose répondent également à la stimulation par LPS/ATP. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la membrane cellulaire reste intacte et exposée à la phosphatidylsérine, et dans les stades ultérieurs, la membrane cellulaire perd son intégrité. Ici, la cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la double coloration de l’annexine V et de la 7-aminoactinomycine D (AAD) afin de détecter la mort cellulaire des cellules entières. Les résultats montrent que des cellules substantielles sont mortes après une stimulation avec LPS/ATP. À l’aide de la microscopie électronique à balayage, nous observons les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles. Les résultats indiquent que les cellules peuvent subir une pyroptose, une apoptose ou une nécroptose après stimulation avec LPS/ATP. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort des macrophages après stimulation avec LPS/ATP. Les résultats ont montré que la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP n’est pas limitée à la pyroptose et que l’apoptose et l’apoptose nécrotique peuvent également se produire, aidant les chercheurs à mieux comprendre la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP et à choisir une meilleure méthode expérimentale.
Introduction
La mort cellulaire est un processus physiologique fondamental chez tous les organismes vivants. Ces dernières années, des études substantielles ont montré que la mort cellulaire est impliquée dans l’immunité et l’équilibre de l’organisme. L’étude de la mort cellulaire nous aide à mieux comprendre l’apparition et le développement des maladies. Plusieurs formes de mort cellulaire programmée ont été décrites, et certaines cibles clés de ces processus ont été identifiées. La pyroptose, l’apoptose et la nécroptose sont les trois voies de mort cellulaire programmées définies génétiquement impliquées dans l’équilibre interne et la maladie1.
La pyroptose se caractérise par la formation de pores membranaires et la libération du contenu cellulaire. Les caspases activées ou granzymes clivent les gasdermines pour séparer leurs domaines N-terminaux, qui s’oligomérisent ensuite, se lient à la membrane et forment des pores 2,3,4. Le pore de gasdermine fournit un canal de sécrétion atypique à travers les membranes cellulaires, ce qui entraîne des réponses cellulaires en aval, y compris la libération de contenu et l’afflux d’ions 2,3,4. En fin de compte, les cellules subissent finalement une rupture de la membrane plasmique et une lyse pyroptotique facilitée par la ninjurine-15. Dans l’apoptose, Bax et Bak activés forment des oligomères sur la membrane externe mitochondriale et libèrent le cytochrome C, qui est régulé par un équilibre entre les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques de la famille BCL-2, les caspases initiatrices (caspases-8, -9 et -10) et les caspases effectrices (caspases-3, -6 et -7)1,6,7. Les changements morphologiques de l’apoptose comprennent la coloration membranaire, le rétrécissement cellulaire, la fragmentation nucléaire, la condensation de la chromatine et la formation de corps apoptotiques 6,8. La sérine/thréonine-protéine kinase 1 (RIPK3) et la kinase de lignée mixte de type domaine (MLKL) sont deux composants centraux en aval du mécanisme nécroptotique1. RIPK3 recrute et phosphoryle MLKL, p-MLKL oligomérise, s’associe à la membrane cellulaire, initie les perforations membranaires, provoque un afflux d’ions, augmente l’osmolarité intracellulaire et finalement la rupture cellulaire 6,9. Les gasdermines et MLKL se lient à la membrane plasmique et médient respectivement la pyroptose et la nécroptose, tandis que BAX/BAK médie l’apoptose en se liant à la membrane externe des mitochondries6.
Bien que chaque voie ait des mécanismes et des résultats spécifiques, elles entraînent des changements similaires sur la membrane cellulaire. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine (PS) n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la PS sera exposée, à l’extérieur de la membrane plasmique. La caspase-3/caspase-7 active les familles TMEM16 et XKR, ce qui conduit à une membrane cellulaire asymétrique et extériorise la PS lors de l’apoptose10. L’influx de Ca2+ médié par la gasdermine D et MLKL entraîne une perte de symétrie de la bicouche phospholipidique sur la membrane cellulaire et l’exposition de PS. L’exposition se produit avant la perte d’intégrité de la membrane cellulaire11,12. Sur la base des changements similaires dans la membrane de ces trois types de mort cellulaire programmée, nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser la double coloration de l’annexine V/7-aminoactinomycine D (7-AAD) afin de détecter la mort cellulaire. L’annexine V, une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du calcium, a une grande affinité pour le PS, qui peut servir de sonde sensible pour détecter le PS exposé à la surface de la membrane plasmique13. Le 7-AAD est une coloration d’acide nucléique qui ne peut pas traverser toute la membrane cellulaire. Il est similaire à l’iodure de propidium (PI), un colorant d’acide nucléique couramment utilisé. Ils ont des caractéristiques de fluorescence similaires, mais le 7-AAD a un spectre d’émission plus étroit et moins d’interférences avec d’autres canaux de détection. En raison de ces similitudes, il ne suffit pas de faire la distinction entre la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose. Nous avons utilisé la cytométrie en flux pour détecter la mort cellulaire à partir de cellules entières. Une deuxième méthode est utilisée pour capturer la membrane cellulaire à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) afin d’observer les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles.
Nous avons établi un modèle de dépôt lipidique différencié du dépôt lipidique différencié dans le monocyte humain (THP-1) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort cellulaire plutôt que sur l’étude des mécanismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, deux méthodes ont été utilisées pour détecter la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. La double coloration à l’annexine V/7-AAD a été utilisée, et les résultats ont été analysés par cytométrie en flux à partir de la coloration globale. Comme pour les autres analyses cytométriques en flux, un groupe de cellules non colorées et deux groupes de cellules monocolorées ont été mis en place pour exclure les résultats faussement positifs et fau…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous exprimons notre grande gratitude à Jiayi Sun et Lu Yang de l’Institut innovant de médecine et de pharmacie chinoises de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu, pour leur aide en cytométrie en flux, à Cuiping Chen du Laboratoire d’État des ressources de la médecine chinoise du sud-ouest, pour leur aide en microscopie électronique à balayage. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [82104491], la Fondation des sciences naturelles du Sichuan [2023NSFSC0674] et la Fondation des sciences postdoctorales de Chine [2021M693789].
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
References
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
- Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
- Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
- Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
- Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
- Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
- Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
- Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
- Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
- Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
- JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
- Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
- Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
- Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
- Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
- Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
- Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
- Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
- Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
- Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
- Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
- Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
- Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
- Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).
