全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発
Summary
全体プラスミドの部位特異的突然変異誘発は、元のプラスミドのわずかに異なるバリエーションを作成する簡単な方法です。ここでは、プラスミドを使用して、標準試薬に塩基置換を導入しやすいと費用対効果の高い方法を示しています。
Abstract
全体プラスミドの部位特異的突然変異誘発は、元のプラスミドのわずかに異なるバリエーションを作成する簡単な方法です。この方法ではクローン化された標的遺伝子は、直接プラスミドに数個の塩基の置換、欠失または挿入することで変更できます。これは単に非PCRベースの熱サイクル反応で、全体のプラスミドを増幅することによって動作します。反応中に所望の変異を運ぶ突然変異誘発性プライマーは、、、新たに合成されたプラスミドに組み込まれています。このビデオチュートリアルでは、プラスミドに塩基置換を導入しやすいと費用対効果の高い方法を示しています。プロトコルは、標準試薬と連携し、多くの場合非常に高価な市販のキット、から独立しています。このプロトコルを適用すると、それは市販のキットのいくつかを使用して、かかるコストの8位に反応のトータルコストを削減することができます。このビデオでは、また、プロセス中の重要な手順についてはコメントおよび突然変異誘発プライマーを設計する方法に関する詳細な指示を与える。
Protocol
Discussion
部位特異的突然変異誘発は、プラスミドによって運ばれる遺伝子を変異させる高速な方法を提供する変異導入法です。全体の反応は、一日で行うことができます。この方法では、それだけで所望の変異とそのようなPFU -ポリメラーゼのようなプルーフリーディングポリメラーゼを運んで無料のプライマーのペアが必要になります。新たに合成されたプラスミドを制限酵素DpnIとの反応を消化し?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pfu polymerase (recombinant or native) | fermentas | EP0571 or EP0501 | ||
| dNTP mix 10 mM | fermentas | R0191 | ||
| DpnI or DpnI Fast digest | fermentas | ER1701 | ||
| primers | invitrogen | desalted |
Referenzen
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
