Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Summary

Mutagénesis dirigida de los plásmidos es toda una forma sencilla de crear variaciones ligeramente diferentes de un plásmido original. Aquí se demuestra de una manera fácil y rentable para introducir sustituciones de bases en un plásmido usando reactivos estándar.

Abstract

Mutagénesis dirigida de los plásmidos es toda una forma sencilla de crear variaciones ligeramente diferentes de un plásmido original. Con este método el objetivo de genes clonados pueden ser alterados por la sustitución, supresión o inserción de unas cuantas bases directamente en un plásmido. Funciona simplemente amplificando el conjunto del plásmido, en una reacción de termociclado no basados ​​en la PCR. Durante la reacción de primers mutagénicos, portadores de la mutación deseada, se integran en el plásmido de nueva síntesis. En este video tutorial se demuestra de una manera fácil y rentable para introducir sustituciones de bases en un plásmido. El protocolo trabaja con reactivos de referencia y es independiente de los kits comerciales, que a menudo son muy caros. La aplicación de este protocolo se puede reducir el costo total de una reacción a una octava parte de lo que cuesta utilizar algunos de los kits comerciales. En este vídeo también comentarios sobre los pasos críticos durante el proceso y dará instrucciones detalladas sobre cómo diseñar los primers mutagénicos.

Protocol

Principio del método: El sitio de mutagénesis dirigida de los plásmidos todo se explica en este video es un método de mutagénesis que le permite modificar un gen diana clonado por sustitución, supresión o inserción de unas cuantas bases directamente en un plásmido. Funciona mediante la amplificación de todo el plásmido, en una reacción de termociclado no basados ​​en la PCR. Durante la reacción de primers mutagénicos, portadores de la mutación deseada en forma de desajustes …

Discussion

Mutagénesis dirigida es un método de mutagénesis, que proporciona una forma rápida de mutar un gen transportado por un plásmido. La reacción general se puede hacer en un solo día. Con este método, sólo necesitará un par de cebadores de cortesía llevar a las mutaciones deseadas y una revisión de la polimerasa como PFU-polimerasa. El plásmido de nueva síntesis se puede separar de los padres plásmido por digestión de la reacción con la enzima de restricción DpnI. Esta enzima digiere sólo el ADN metilado….

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
Pfu polymerase (recombinant or native)		fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM		fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest		fermentas	ER1701
primers		invitrogen		desalted