Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Summary

Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Aqui nós demonstramos uma forma fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo reagentes padrão usando.

Abstract

Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Com este método, o gene-alvo clonados podem ser alterados pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ela funciona por simplesmente ampliar o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada, são integrados no plasmídeo recém-sintetizada. Neste vídeo tutorial vamos demonstrar uma maneira fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo. O protocolo trabalha com reagentes de referência e é independente de kits comerciais, que muitas vezes são muito caros. Aplicando este protocolo pode reduzir o custo total de uma reação a um oitavo do que custa o uso de alguns dos kits comerciais. Neste vídeo também comentar sobre as etapas críticas durante o processo e dar instruções detalhadas sobre como desenhar os iniciadores mutagênicos.

Protocol

Princípio do método: O site dirigido mutagênese de plasmídeos toda explicada neste vídeo é um método de mutagênese que permite que você alterar um gene alvo clonado pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ele funciona, amplificando o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada na forma de incompatibilidades para o plasmídeo original, …

Discussion

Mutagênese dirigida local é um método de mutagênese, que fornece uma maneira rápida de mutação de um gene transportado por um plasmídeo. A reação geral pode ser feito em apenas um dia. Com este método, ele vai precisar de apenas um par de primers complementares levando a mutações desejadas e uma revisão da polimerase como Pfu Polimerase. O plasmídeo recém-sintetizado pode ser separado do plasmídeo parental por digerir a reação com o DpnI enzima de restrição. Esta enzima digere apenas o DNA metilado….

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
Pfu polymerase (recombinant or native)		fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM		fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest		fermentas	ER1701
primers		invitrogen		desalted