على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase
Summary
ويتم رصد نشاط كربوكسيل محرض يسين عن طريق تفاعل الركيزة L – يسين وكادافيرين المنتج مع 2،4،6 trinitrobenzensulfonic الحمضية لتشكيل adducts التي الذوبان في الفرق التولوين.
Abstract
كولاي هي البكتيريا المعوية التي هي قادرة على النمو أكثر من مجموعة واسعة من قيم الرقم الهيدروجيني (درجة الحموضة) 9 — 5 1 ، وبشكل لا يصدق ، قادرة على البقاء على قيد الحياة حمض المدقع تؤكد بما في ذلك المرور عبر المعدة الثدييات حيث درجة الحموضة يمكن أن تقع على أنها منخفضة ودرجة الحموضة 1-02 فبراير. لتمكين هذه مجموعة واسعة من بقاء درجة الحموضة الحمضية ، E. القولونية يمتلك أربعة أنواع مختلفة من الأحماض الأمينية decarboxylases محرض decarboxylate أن الأحماض الأمينية الركيزة بهم بطريقة بروتون التي تعتمد على رفع درجة الحموضة وبالتالي الداخلية. وdecarboxylases تشمل حمض الغلوتاميك decarboxylases جدة وGadB 3 ، وجهاز أبوظبي للاستثمار كربوكسيل أرجينين 4 ، كربوكسيل يسين LdcI 5 و 6 و 7 كربوكسيل الأورنيثين SpeF. كل هذه الانزيمات الاستفادة بيريدكسال – 5' – phospate كعامل المشترك (8) وظيفة مع antiporters الركيزة المنتج ، التي تعمل على إزالة الغشاء الداخلي للمنتجات نزع الكربوكسيل الخارجية في المتوسط مقابل 2 الركيزة الطازجة. في حالة LdcI ، يسمى antiporter يسين – كادافيرين CadB. مؤخرا ، مصممون على التركيب البلوري للأشعة السينية من LdcI إلى 2.0 ، واكتشفنا رواية صغيرة جزيء منضمة إلى LdcI المنظم استجابة صارمة غوانوزين 5' – ثنائي فسفات ، 3' – ثنائي فسفات (ppGpp) 14. استجابة صارمة يحدث عندما الخلايا المتنامية باطراد تجربة الحرمان المغذيات أو واحد من عدد من الضغوط الأخرى 9. نتيجة لذلك ، تنتج خلايا ppGpp الأمر الذي يؤدي إلى تتالي إشارات وبلغت ذروتها في التحول من النمو المتسارع للنمو ثابتة المرحلة 10. لقد أثبتنا أن ppGpp هو المانع محددة من LdcI 14. نحن هنا وصف مقايسة كربوكسيل يسين ، من تعديل المقايسة التي وضعتها فان وآخرون 11 ، التي استخدمناها لتحديد نشاط LdcI وتأثير pppGpp / ppGpp على هذا النشاط. تفاعل نزع الكربوكسيل LdcI يزيل مجموعة α – L – كربوكسي ليسين وينتج غاز ثاني أكسيد الكربون وكادافيرين البوليامين (1،5 – diaminopentane) 5. يمكن أن يكون رد فعل L – يسين وكادافيرين مع 2،4،6 – trinitrobenzensulfonic حمض (TNBS) عند درجة الحموضة العالية لتوليد N ، N' bistrinitrophenylcadaverine – (TNP – كادافيرين) و N ، N' bistrinitrophenyllysine – (TNP – يسين) ، على التوالي 11. ويمكن فصل TNP – كادافيرين من ليسين ، كما TNP السابق قابل للذوبان في المذيبات العضوية مثل التولوين في حين أن الأخيرة ليست (أنظر الشكل 1). تم تحديد مجموعة خطية من مقايسة به تجريبيا كادافيرين المنقى.
Protocol
Discussion
في مقايسة كربوكسيل يسين ، هو رد فعل TNBS مع الأمينات الأولية من L – يسين وكادافيرين لتشكيل ليسين وTNP – TNP – كادافيرين adducts (الشكل 1). نظرا لوجود مجموعة من حمض الكربوكسيلية على TNP – يسين ، وهذا ناتج إضافة تبقى قابلة للذوبان في الماء بينما TNP – كادافيرين ، التي تفتقر إلى مجموعة حم?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور الدكتور مايكل كشل] (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MA ، الولايات المتحدة) لارسال لنا سلالات بكتيرية ، وبلاسميدات ، والبروتوكولات اللازمة. نشكر الدكتور جون غلوفر (قسم الكيمياء الحيوية في جامعة تورنتو) لاستخدام لوحة SpecraMax القارئ. المملكة المتحدة هي المستفيدة من العلوم الوطنية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) منحة دراسية عليا ، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة برنامج التدريب الاستراتيجية في البيولوجيا البنيوية للبروتينات غشاء مرتبط بمرض ، وزمالة جامعة تورونتو المفتوحة. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (MOP – 67210) لواه.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Referenzen
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemie. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
