Тест для измерения активности Кишечной палочки Индуцибельной Лизин Decarboxyase
Summary
Активности индуцибельной лизина декарбоксилазы контролируется путем взаимодействия подложки L-лизина и кадаверина продукт с 2,4,6-trinitrobenzensulfonic кислотой с образованием аддуктов, которые дифференциальных растворимость в толуоле.
Abstract
Кишечная палочка является кишечных бактерий, которые способны растущих в широком диапазоне рН (рН 5 – 9) 1 и, невероятно, способен выжить крайне кислоты подчеркивает, включая проход через млекопитающих желудок, где рН может опуститься до как рН 1 – 2 2. Чтобы включить такой широкий ассортимент кислотных выживания рН, Е. палочка обладает четырьмя различными индуцибельной аминокислот декарбоксилазы кислоту, которая декарбоксилирование субстрата их аминокислот в протон-зависимым образом повышая внутренние рН. Декарбоксилазы включают декарбоксилазы глутаминовой кислоты Гада и GadB 3, аргинин декарбоксилазы Adia 4, лизин декарбоксилазы LdcI 5, 6 и орнитиндекарбоксилазы SPEF 7. Все эти ферменты используют пиридоксаль-5'-фосфат в качестве со-фактор 8 и функционировать вместе с внутренней мембраны субстрат-продукт антипортеры, которые удаляют декарбоксилирования продукции на внешнем носителе, в обмен на свежий субстрат 2. В случае LdcI, лизин-кадаверин антипортера называется CadB. Недавно мы определили рентгеновского кристаллической структуры LdcI до 2,0 Å, и мы обнаружили, роман малые молекулы связаны с LdcI строгие гуанозин регулятор ответа 5'-дифосфат, 3'-дифосфат (ppGpp) 14. Строгий ответ возникает, когда экспоненциально растущих клеток опыт питательных лишения или один из ряда других напряжений 9. В результате клетки производят ppGpp что приводит к сигнальный каскад кульминацией переход от экспоненциального роста к стационарным фазе роста 10. Мы показали, что ppGpp является специфическим ингибитором LdcI 14. Здесь мы опишем лизина анализа декарбоксилазы, модифицированный из анализа разработан Фан соавт. 11, которые мы использовали для определения активности LdcI и эффект pppGpp / ppGpp на эту деятельность. Реакция LdcI декарбоксилирования удаляет α-карбоксильной группы L-лизина и производит углекислый газ и полиаминов кадаверин (1,5-diaminopentane) 5. L-лизина и кадаверина может реагировать с 2,4,6-trinitrobenzensulfonic кислоты (TNBS) при высоких рН для получения N, N-bistrinitrophenylcadaverine (ТНП-кадаверин) и N, N-bistrinitrophenyllysine (ТНП-лизин), соответственно 11. ТНП-кадаверин могут быть отделены от ТНП-лизин, как бывший растворим в органических растворителях, таких как толуол в то время как последняя не является (см. Рисунок 1). Линейный диапазон анализа был определен эмпирически с использованием очищенных кадаверин.
Protocol
Discussion
В лизина анализа декарбоксилазы, TNBS реагирует с первичными аминами из L-лизина и кадаверина сформировать ТНП-лизина и ТНП-кадаверин аддуктов (рис. 1). В связи с наличием группы карбоновой кислоты на ТНП-лизин, этот аддукт остается растворим в воде, а ТНП-кадаверин, не имея группы карбоново…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Д-р Майкл Кашел (Национальный институт здоровья, Бетезда, штат Массачусетс, США) за отправку бактериальные штаммы, плазмиды, и необходимые протоколы. Мы благодарим д-р Джон Гловер (кафедра биохимии, Университет Торонто) для использования читателя пластины SpecraMax. Великобритания является лауреатом Национальной наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) последипломного стипендии канадского института стратегических исследований в области здравоохранения учебной программы в структурной биологии мембранных белков Связанный с болезнями, а также Университета Торонто стипендий Open. Эта работа была поддержана грантом от Канадского института исследований в области здравоохранения (СС-67210), чтобы WAH.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Referenzen
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemie. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
