の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase
Summary
誘導性リジン脱炭酸酵素の活性は、基質のL -リジンとトルエンで、差動溶解度を持っている付加体を形成するために、2,4,6 – trinitrobenzensulfonic酸による製品のカダベリンを反応させることによって監視されます。
Abstract
1と、信じられないほど、低いとpHが落ちることができる哺乳類の胃の通過を含む極端な酸応力に耐えることができるか- 大腸菌では、pH値（9 pHは5）の広い範囲で成長することができる腸内細菌です。 2 2 – pHを1として。酸性pHの生存、E.のような広い範囲を有効にするには大腸菌は、プロトン依存的に脱炭酸、その基質のアミノ酸はこのように内部のpHを上げることつの異なる誘導アミノ酸decarboxylasesを持っています。 decarboxylasesはグルタミン酸decarboxylasesガダとGadB 3、アルギニンデカルボキシラーゼ不透過4、リジン脱炭酸酵素LdcI 5、6、オルニチンデカルボキシラーゼSPEF 7を含める。これらの酵素のすべてが新鮮な基板2と引き換えに、外部媒体への脱炭酸の製品を削除する内側の膜基板-製品のアンチポーターと一緒にコファクター8および関数としてピリドキサール5' – phospateを利用する。 LdcIの場合には、リジン-カダベリンアンチポーターはCADBと呼ばれています。最近、我々は、2.0 ÅにLdcIのX線結晶構造を決定し、そして我々はLdcI厳しいレスポンスレギュレーターのグアノシン5' -二リン酸、3' -二リン酸（ppGppの）14に結合した新規の低分子化合物を発見した。指数関数的に成長する細胞が栄養枯渇や他のストレス9の数字のいずれかが発生するときに緊縮応答が発生します。その結果、細胞が定常期の成長率は10〜急激な成長からのシフトで最高潮に達するシグナル伝達カスケードにつながるppGppのを作り出す。我々は、ppGppのはLdcI 14の特異的阻害剤であることが実証されている。ここでは、ファンティエットらによって開発されたアッセイから変更。11、我々はLdcIの活動とその活動上pppGpp / ppGppのの効果を決定するために使用されていることを、リジン脱炭酸酵素のアッセイを説明します。 LdcIの脱炭酸反応は、L -リジンのα-カルボキシ基を除去し、二酸化炭素とポリアミンカダベリン（1,5 -ジアミノペンタン）5を生成します。 L -リジンとカダベリンは、それぞれ、N、N' – bistrinitrophenylcadaverine（TNP -カダベリン）とN、N' – bistrinitrophenyllysine（TNP -リジン）を生成するために、高pHで2,4,6 – trinitrobenzensulfonic酸（TNBS）と反応させることができます。 11。後者は（図1参照）ではない。前者はトルエンなどの有機溶媒に可溶であるとしてTNP -カダベリンは、TNP -リジンから分離することができる。アッセイの直線範囲は、経験的に精製カダベリンを用いて決定した。
Protocol
Discussion
リジン脱炭酸酵素のアッセイでは、TNBSは、TNP -リジンとTNP -カダベリン付加体（図1）を形成するために、L -リジンとカダベリンの第一級アミンと反応させる。 TNP -カダベリンは、カルボン酸基を欠く、トルエン11に分割することができる間、TNP -リジン上にカルボン酸基の存在のために、この付加物は水に可溶のまま。このタイプのアッセイは、カルボン酸基の消失が反応中に発生す?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、私たち菌株、プラスミド、および必要なプロトコルを送信するための博士マイケルキャシェル（国立衛生研究所、ベセスダ、MA、米国）を感謝。我々はSpecraMaxプレートリーダーを使用するためにドクタージョングローバー（生化学部、トロント大学を）感謝。英国では、国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）大学院奨学金、疾病へのリンク膜タンパク質の構造生物学、およびトロントオープンフェローシップの大学における保健研究戦略的トレーニングプログラムのカナダの協会の受信者です。この作品は、カナダ衛生研究所（MOP – 67210）からWAHへの助成金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Referenzen
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