의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible
Summary
inducible 리진 탈카복실화효소의 활동은 톨루엔에 차등 용해도를 부가물을 형성 2,4,6 – trinitrobenzensulfonic의 소산으로 기판 L – 라이신과 제품 cadaverine을 반응에 의해 모니터링됩니다.
Abstract
1, 매우 낮은로 산도가 가을 수있는 포유류의 위장을 통해 통로를 포함하여 극단적인 산성 스트레스를 이겨낼 수있다 – 대장균은 산도 값 (9 산도 5) 다양한 범위에서 성장이 가능합니다 장용 박테리아입니다 로 산도 2월 1일부터 2일까지. 산성 산도의 생존, E. 이러한 광범를 활성화하려면 대장균은 양성자 종속적인 방식으로 decarboxylate 자신의 기판 아미노산이 때문에 내부 산도를 높여 그 네 가지 inducible 아미노산 decarboxylases을 가지고 있습니다. decarboxylases은 glutamic 산성 decarboxylases 가다와 GadB 3, 아르기닌 탈카복실화효소 AdiA 4 리진 탈카복실화효소 LdcI 5, 6 및 ornithine 탈카복실화효소 SpeF 7 포함되어 있습니다. 이러한 효소의 모든 공동 요소 8로 피리 독살 – 5' – phospate 활용과 신선한 기판 2 교환에 외부 매체 decarboxylation 제품을 제거 – 멤브레인 내부 기판 – 제품 antiporters와 함께 작동합니다. LdcI의 경우, 라이신 – cadaverine antiporter은 CadB라고합니다. 최근, 우리는 2.0 Å에 LdcI의 X – 선 결정 구조를 결정하고, 우리는 LdcI 엄격한 응답 조절기 구아 노신 5' – diphosphate, 3' – diphosphate (ppGpp)가 14 바운드 소설 작은 분자를 발견했다. 기하 급수적으로 성장하는 세포가 영양 부족이나 기타 스트레스 9 숫자 중 하나가 발생할 때 엄격한 응답이 발생합니다. 그 결과, 세포는 고정 위상 성장 10 기하 급수적인 성장의 변화에 culminating 신호 계단식으로 연결 ppGpp을 생산합니다. 우리는 ppGpp는 LdcI 14 특정 억제제는 것을 증명하고있다. 우리가 판 외 개발한 분석에서 수정된 라이신 탈카복실화효소 분석을 설명합니다. 11, 우리가 LdcI의 활동과 그 활동에 pppGpp / ppGpp의 효과를 결정하는 데 사용했다고. LdcI의 decarboxylation 반응은 L – 라이신의 α – 카르복시 그룹을 제거하고 이산화탄소 및 polyamine cadaverine (1.5 – diaminopentane) 5을 생산하고 있습니다. L – 라이신과 cadaverine는 각각 N, N' – bistrinitrophenylcadaverine (TNP – cadaverine)와 N, N' – bistrinitrophenyllysine (TNP – 라이신)을 생성하기 위해 높은 산도에서 2,4,6 – trinitrobenzensulfonic 산성 (TNBS)와 반응 수 있습니다 11. TNP – cadaverine은 후자가 (그림 1 참조)는 아니지만, 전 그런 톨루엔과 같은 유기 용제에 용해와 같이 TNP – 라이신으로부터 분리 수 있습니다. 분석의 선형 범위는 경험적으로 정화 cadaverine를 사용하여 결정되었다.
Protocol
Discussion
리진 탈카복실화효소 분석에서 TNBS은 TNP – 라이신과 TNP – cadaverine 부가물 (그림 1)을 형성 L – 라이신과 cadaverine의 기본 아민과 반응입니다. 카르복실산 그룹을 부족 TNP – cadaverine은, 톨루엔 11로 분할 할 수있는 동안 TNP – 라이신의 카르복실산 그룹의 존재로 인해,이 adduct은 물에 용해 남아 있습니다. 분석의이 유형은 카르복실산 그룹의 손실이 반응 중에 발생하는 아미노산의 다른 유형에 대?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리에게 박테리아 변종, plasmids, 필요한 프로토콜을 보내는 박사 마이클 카쉘을 (건강, 베데스다, MA, 미국의 국립 연구소) 감사합니다. 우리는 SpecraMax 플레이트 리더 사용에 대한 박사 존 글로버를 (생화학학과, 토론토 대학) 감사합니다. 영국 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC) 대학원 장학금, 질병에 링크된 막 단백질의 구조 생물의 건강 연구 전략 훈련 프로그램의 캐나다 연구소, 그리고 토론토 오픈 원정대의 대학의받는 사람입니다. 이 작품은 WAH로 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 – 67210)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Referenzen
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemie. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
