用于测量的活性测定大肠埃希氏菌诱导赖氨酸Decarboxyase
Summary
2,4,6 – trinitrobenzensulfonic酸反应的底物L -赖氨酸和产品尸形成加合物在甲苯的溶解度差，诱导赖氨酸脱羧酶的活动都受到监控。
Abstract
大肠杆菌是肠道细菌能够较广泛的pH值（pH值5 – 9）增长1的，令人难以置信的，是能够生存的极端酸强调，通过哺乳动物的胃pH值下降，包括通过低作为pH值1 – 2 2。为了使这样一个广泛偏酸生存，E.大肠杆菌拥有四种不同的诱导氨基酸decarboxylases decarboxylate基板在质子依赖性氨基酸，从而提高内部的pH值。 decarboxylases包括谷氨酸decarboxylases嘎达和GadB 3，精氨酸脱羧酶ADIA 4，赖氨酸脱羧酶LdcI 5，6和7鸟氨酸脱羧酶SPEF。所有这些酶的利用吡哆醛-5 -磷酸作为共同因子8，函数内的膜基板产品逆向转运，删除脱羧产品在外部介质换取新鲜的基板2。在LdcI的情况下，赖氨酸尸逆向转运蛋白被称为农发行。最近，我们确定了X射线晶体结构的LdcI 2.0 A，我们发现了一个新的小分子绑定到LdcI严格的反应调节鸟苷5' -二磷酸，3' -二磷酸果糖（ppGpp）14 。严格的反应时，会发生细胞急剧增长的经验营养剥夺或其他9讲。因此，细胞产生ppGpp导致信号级联，最终从指数的增长转移到固定相增长10。我们已经证明，ppGpp是LdcI 14特异性抑制剂。在这里，我们描述赖氨酸脱羧酶检测，修改从藩等人开发的的实验。11，我们用于确定LdcI活动pppGpp / ppGpp该活动的影响。 LdcI脱羧反应，消除了L -赖氨酸的α-羧基组和产生的二氧化碳和尸胺（1,5 – diaminopentane） 5。 L -赖氨酸和尸，可在高pH值2,4,6 trinitrobenzensulfonic酸（TNBS）反应生成N，N – bistrinitrophenylcadaverine（TNP -尸）和N，N' – bistrinitrophenyllysine（TNP -赖氨酸），分别11。 TNP -尸可以分开，前者是可溶于有机溶剂，如甲苯，而后者则没有（见图1），TNP -赖氨酸。检测的线性范围为使用纯化尸凭经验确定。
Protocol
Discussion
赖氨酸脱羧酶试验，TNBS是L -赖氨酸和尸伯胺反应形成，TNP -赖氨酸和TNP -尸加合物（图1）。由于TNP -赖氨酸的羧酸基团的存在，这种加合物仍然易溶于水，而TNP -尸，缺乏羧酸 ，甲苯11分区。其他类型羧酸组的损失发生在反应过程中的氨基酸，可以更广泛地利用这类型的检测。这发生在L -鸟氨酸诱导鸟氨酸脱羧酶SPEF的脱羧形成多胺腐胺和L -精氨酸脱羧诱导精氨酸脱羧酶ADIA形成多胺胍丁…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢博士博士迈克尔卡舍尔（，贝塞斯达，MA，美国国家卫生研究院）向我们发送菌株，质粒和必要的协议。我们感谢SpecraMax酶标仪约翰格洛弗（博士，加拿大多伦多大学生物化学系）。英国是一个国家科学与工程研究理事会，加拿大（NSERC）的研究生奖学金，加拿大在与疾病相关的膜蛋白的结构生物学研究所的卫生研究战略培训计划，及多伦多大学打开奖学金获得者。这项工作是支持由授予的加拿大卫生研究院（澳门币67210）往华。
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Referenzen
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