تحديد البكتيريا عملية الأيض نشطة في الوتر من اختصاصي<em> ورق القطن littoralis</em> عن طريق الحمض النووي النظائر مستقرة جس طريق<sup> 13</sup> C-الجلوكوز
Summary
المجتمع البكتيرية النشطة المرتبطة أمعاء littoralis ورق القطن، والتي يحددها مستقرة-سبر النظائر (SIP) بالإضافة إلى pyrosequencing. باستخدام هذه المنهجية، وقد تم التعرف على الأنواع البكتيريا عملية الأيض نشطة داخل المجتمع مع ارتفاع القرار والدقة.
Abstract
الشجاعة لمعظم الحشرات ويسكنها مجتمعات معقدة من البكتيريا التكافلية غير إمراضية. داخل هذه المجتمعات الميكروبية فمن الممكن لتحديد الأنواع المتعايشة أو البكتيريا المنفعة المتبادلة. تلك الأخيرة، وقد لوحظ أن تخدم وظائف متعددة لحشرة، أي مساعدة في مجال الإنجاب الحشرات 1، وتعزيز الاستجابة المناعية 2، وإنتاج فرمون 3، وكذلك التغذية، بما في ذلك تركيب الأحماض الأمينية الأساسية 4، وغيرها.
نظرا لأهمية هذه الجمعيات، وقد بذلت الكثير من الجهود لتميز المجتمعات وصولا الى أعضاء الفردية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الجهود استندت إما على طرق الزراعة أو الاعتماد على توليد شظايا الجينات 16S الرنا الريباسي التي كانت لتحديد التسلسل النهائي. للأسف، حدد هذه الأساليب فقط الأنواع البكتيرية الموجودة في الأمعاء وعدم تقديم المعلومات حول عمليةايون على النشاط الأيضي من الكائنات الحية الدقيقة.
لتوصيف الأنواع البكتيرية عملية الأيض نشطة في القناة الهضمية للحشرة، وكنا النظائر مستقرة التحقيق (SIP) في الجسم الحي توظيف 13 C-الجلوكوز باعتباره الركيزة عالمية. هذا هو أسلوب خالية من الثقافة الواعدة التي تتيح الربط بين phylogenies الميكروبية إلى النشاط الأيضي الخاصة. هذا ممكن من خلال تتبع مستقرة، وصفت ذرات النظائر من ركائز في المؤشرات الحيوية الميكروبية، مثل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي 5. إدماج 13 C النظائر في الحمض النووي يزيد من كثافة الحمض النووي المسمى مقارنة أونلبلد (12 C) واحدة. في النهاية، يتم فصل الحمض النووي 13 C المسمى أو الحمض النووي الريبي التي كتبها الكثافة تنبيذ فائق التدرج من 12 C-أونلبلد مماثلة واحدة 6. التحليل الجزيئي لاحقة من isotopomers الحمض النووي يوفر فصل العلاقة بين النشاط الأيضي وهوية الأنواع.
هنا، فإننا نقدم البروتوكول المستخدم لوصف عملية الأيض نشطة البكتيريا في أمعاء حشرة اختصاصي (نظام نموذجنا)، littoralis ورق القطن (قشريات الجناح، Noctuidae). وقد تم تحليل النشوء والتطور من الحمض النووي باستخدام pyrosequencing، مما سمح عالية الدقة والدقة في تحديد القناة الهضمية للحشرات المجتمع البكتيرية. والركيزة الرئيسية، وكان يستخدم الجلوكوز 13 C المسمى في التجارب. كان يتغذى الركيزة إلى الحشرات باستخدام نظام غذائي الاصطناعي.
Introduction
ومن المعروف الجمعيات التكافلية الحشرات للبكتيريا لعدد كبير من أنواع الحشرات 7. في هذه الجمعيات التكافلية، والكائنات الدقيقة تلعب دورا هاما في نمو وتطور الحشرات. وقد ثبت أن الميكروبات إلى المساهمة في التكاثر الحشرات 1، 3 فرمون الحيوي، والتغذية، بما في ذلك تركيب الأحماض الأمينية الأساسية 4، وهضم الطعام قابلة للوصول إلى المضيف. على الرغم من مجموعة واسعة من الجمعيات العاملة في الأمعاء البكتيرية، كما هو معروف أقل بكثير عن دور وظيفي أنها تلعب لصالح الحشرات. فقط في حالة النمل الأبيض، والهضم التكافلية من مادة الخشب التي يقوم بها بدائيات النوى، البروتوزوا والفطريات، وقد درس على نطاق واسع 8،9. وعلى النقيض من ذلك، لا يعرف إلا القليل عن علاقة تكافلية موجودة في القناة الهضمية للحشرات اختصاصي دودة ورق القطن أي، ورق القطن littoralis. وعلاوة على ذلك، وذلك بسبب التحول المتكرر الجنود النبات، عامويتعرض الخاصة العراقية الحشرات والأمعاء البكتيرية المجتمعات المرتبطة بها بشكل دائم إلى التحديات الجديدة المرتبطة عادات التغذية الخاصة بهم طويلا النباتات مع مجموعة كبيرة من المواد الكيميائية النباتية. بجانب هذا، والبيئة في القناة الهضمية lepidopterans، يمثل في حد ذاته بيئة قاسية لنمو البكتيريا بسبب ارتفاع درجة الحموضة القناة الهضمية 10. لا سيما في حالة S. littoralis، وهي تتراوح بين 10.5 في المعى الأمامي، كاليفورنيا. 9 في المعي المتوسط لدرجة الحموضة ما يقرب من 7 في المعى المؤخر 11. من ناحية أخرى، ويرتبط مع المجتمع البكتيرية أمعاء S. littoralis بسيط. تانغ، Freitak، وآخرون. ذكرت 12 كحد أقصى 36 phylotypes ينتمون إلى ما مجموعه 7 الأنواع البكتيرية المختلفة وأعضاء فقط من المجتمع البكتيرية المصاحبة لهذه الحشرات. وبالاضافة الى هذا، لا يلزم إجراء تربية معقدة لنمو الحشرات في المختبر. وعلاوة على ذلك، وهذا ودورة حياة قصيرة من الحشرات تسهيل متعدد زدراسات enerational، وتحول هذه الأنواع إلى نظام نموذج مثالي لدراسة التفاعلات القناة الهضمية للميكروب.
مع ظهور تقنيات التسلسل PCR القائم، ازداد عدد من الدراسات التي تتناول القناة الهضمية الكائنات الحية من عدة كائنات (أي البشر والحشرات، أو الكائنات البحرية). وعلاوة على ذلك، فإن النتائج تكون مستقلة من العزلة وزراعة الأمعاء آوى البكتيريا كما هو الحال في الماضي. تقريبا 99٪ من البكتيريا ليست صالحة للزراعة ومحاكاة للظروف البيئية السائدة في القناة الهضمية من الصعب 12. باستخدام PCR، 16S الرنا الريباسي شظايا الجينات (المورثات علامة النشوء والتطور المستخدمة على نطاق واسع بين البكتيريا) يمكن التوسع بشكل انتقائي من قالب الحمض النووي مختلطة من المجتمعات البكتيرية امعاء، والتسلسل، والمستنسخة. مع هذه المعلومات، يكون المستخدم قادرا على تحديد الأنواع البكتيرية بعد استرجاع المعلومات من قواعد البيانات العامة تسلسل 13،14. ومع ذلك، تقترب من التسلسل لوصف البكتيريةلا تزال المجتمعات غير كافية نظرا لعدم وجود معلومات عن مساهمة الأيض لا يتجزأ من الأنواع الفردية داخل المجتمع.
مستقر النظائر التحقيق (SIP) هو تقنية خالية من ثقافة واعدة. وغالبا ما تستخدم في علم الأحياء الدقيقة البيئية لتحليل phylogenies الجراثيم مرتبطة سيما أنشطة الأيضية. ويتحقق هذا من خلال تتبع مستقرة، وصفت ذرات النظائر من ركائز في المؤشرات الحيوية الميكروبية، مثل الأحماض الدهنية المشتقة من الدهون الفوسفاتية، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي 5. عند النظر في الأحماض النووية، ويستند على منهجية فصل 13 الحمض النووي المسمى C أو الحمض النووي الريبي من الحمض النووي غير المسماة التي كتبها الكثافة تنبيذ فائق التدرج 6. ونتيجة لهذا الاتصال المباشر بين تسمية الحمض النووي والنشاط الأيضي، تحليل الجزيئي المصب من الأحماض النووية يحدد الأنواع ويقدم معلومات عن أنشطة الأيضية. علاوة على ذلك، مزيج من الحمض النووي SIP وpyrosequencing الذي يطبقهPilloni، فون نيتسر، 15 آخرون، يسمح بتحديد بسيطة وحساسة خاصة من الأنواع البكتيرية الموجودة في الثقيلة 13-C المسمى DNA الكسر. حتى الآن، وقد تم تطبيق هذه التقنية لوصف المجتمعات البكتيرية المشاركة في العمليات البيولوجية الكيميائية في التربة تحت الهوائية واللاهوائية 16،17 18،19 الظروف. إلى جانب استخدام في العلوم البيئية، وقد تم تطبيق هذه التقنية في العلوم الطبية كما ذكرت من قبل Reichardt، وآخرون. 5، الذي وصف الأنشطة الأيضية لمجموعات مختلفة من النشوء والتطور مجهريات البقعة المعوية الإنسان ردا على الكربوهيدرات غير قابلة للهضم.
هنا نستخدم 13 C-الجلوكوز إلى 'التسمية' الحمض النووي من الأنواع البكتيرية عملية الأيض نشطة في القناة الهضمية. الجلوكوز هو سكر استخدامها من قبل معظم الأنواع البكتيرية على طول نطاق واسع Entner-Doudoroff (ED) المسار، على الرغم من استثناءات معروفة 20. هذايبرر استخدام 13 C-الجلوكوز باعتباره التحقيق الأيض موثوقة التي توفر وصلة بين نواتج الأيض من الاهتمام ومصدر الكربون على طول مسارات ثابتة. اعتمادا على مسألة علمية، ركائز أخرى، أي 13 C-الميثان، 13 CO 2، أو النباتات التي أثيرت في إطار جو 13 CO 2، ويمكن استخدامها للتصدي للأنشطة الأيضية.
عند هذه النقطة، فإننا نقدم البروتوكول المطبق في توصيف التمثيل الغذائي للمجتمع الأمعاء البكتيرية من حشرة اختصاصي، وهما س. littoralis (قشريات الجناح، Noctuidae). علاوة على ذلك، كان إلى جانب هذه التقنية لpyrosequencing، والذي يسمح بدوره بتحديد الحشرات الأمعاء البكتيرية المجتمع مع ارتفاع القرار والدقة. والركيزة الرئيسية، واستخدمت 13 الجلوكوز C المسمى خلال التجارب.
Protocol
Representative Results
Discussion
القناة الهضمية لمعظم الحشرات تؤوي المجتمع الميكروبية غنية ومعقدة، عادة 10 -10 7 9 خلايا أولية النواة تقديم هناك، يفوق عدد خلايا المضيف نفسه في معظم الحالات. وبالتالي، فإن القناة الهضمية للحشرات هو "نقطة ساخنة" للأنشطة الميكروبية متنوعة، تمثل جوانب متعددة من …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر انجيليكا بيرغ للمساعدة المختبر. وأيد هذا العمل وبتمويل من جمعية ماكس بلانك ومدرسة جينا لالميكروبية الاتصالات (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referenzen
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
