Идентификация метаболически активных бактерий в кишечнике в Универсал<em> Spodoptera littoralis</em> Через ДНК стабильный изотоп Зондирование Использование<sup> 13</sup> С-Глюкоза
Summary
Активный бактериальная сообщество связано с кишечнике Spodoptera littoralis, определялась конюшни изотопно-зондирования (SIP), соединенного с пиросеквенирования. С помощью этой методики выявление метаболически активных видов бактерий в рамках сообщества было сделано с высоким разрешением и точностью.
Abstract
Кишки большинства насекомых обитают сложных сообществ симбиотических непатогенных бактерий. В таких микробных сообществ можно определить синантропных или мутуалистических бактерий видов. Последние, были обнаружены служить несколько функций к насекомым, т.е. помогает в воспроизведении насекомых 1, повышая иммунный ответ, продукцию 2 феромона 3, а также питание, в том числе синтеза незаменимых аминокислот 4, среди других.
В связи с важностью этих ассоциаций, многие были предприняты усилия, чтобы охарактеризовать общины вплоть до индивидуальных членов. Тем не менее, большинство из этих усилий были либо на основе методов выращивания или полагались на генерации 16S рРНК фрагментов гена, которые были секвенированных для окончательной идентификации. К сожалению, эти подходы только определили видов бактерий, присутствующих в кишечнике и не предоставил Informatион на метаболической активности микроорганизмов.
Для характеристики метаболически активных видов бактерий в кишечнике насекомого, мы использовали стабильный изотоп зондирования (SIP) в естественных условиях, использующей 13 С-глюкозы в качестве универсального субстрата. Это перспективная культура без метод, который позволяет связь микробных филогений их конкретной метаболической активности. Это возможно путем отслеживания стабильных изотопов, меченых атомов с субстратов в микробных маркеров, таких как ДНК и РНК 5. Включение 13С изотопов в ДНК увеличивает плотность меченого ДНК по сравнению с немеченого (12 C) один. В конце концов, 13 С-меченого ДНК или РНК отделяется в градиенте плотности ультрацентрифугирования от 12 C-немеченого аналогичным один 6. После молекулярный анализ отделенных изотопомеров нуклеиновых кислот обеспечивает связь между метаболической активности и личности вида.
Здесь мы представляем протокол, используемый для характеристики метаболически активные бактерии в кишечнике универсалом насекомого (наша модель системы), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Совки). Филогенетический анализ ДНК было сделано с использованием пиросеквенирования, что позволило высокое разрешение и точность в выявлении кишечной насекомое бактериального сообщества. Как основной подложке, 13 С-меченого глюкозы был использован в экспериментах. Субстрат подавали насекомых с использованием искусственного диету.
Introduction
Насекомых-бактериальные симбиотические ассоциации известны большим количеством видов насекомых 7. В этих симбиотических ассоциаций, микроорганизмы играют важную роль в росте и развитии насекомых. Микробы, как было показано способствовать воспроизводства насекомых 1, феромонов биосинтеза 3, питание, в том числе синтеза незаменимых аминокислот 4, и переваривание пищи недоступной к хосту. Несмотря на огромное разнообразие кишечной-бактериальная объединений, гораздо меньше известно о функциональной роли, которую они играют в пользу насекомого. Только в случае термитов, симбиотические переваривание лигноцеллюлозы осуществляется прокариот, простейших и грибов, был широко изучен 8,9. В отличие от этого, мало что известно о симбиотической ассоциации, присутствующих в кишечнике широкого профиля насекомых т.е. хлопка leafworm, Spodoptera littoralis. Кроме того, из-за их частого смещения растений-хозяев, генеральныйист насекомые и их кишки, связанные бактериальных сообществ постоянно подвергается новым вызовам, связанным с их привычки питания потребляют растения с множеством фитохимические. Кроме этого, в кишечнике среда в чешуекрылых, представляет само по себе жесткую среду для роста бактерий из-за высокого рН содержимого кишечника 10. В частности, в случае S. littoralis, она колеблется от 10,5 в передней кишки, ок. 9 в средней кишке до рН почти 7 в задней кишки 11. С другой стороны, бактериальный сообщество, связанный с кишечнике S. littoralis прост. Тан, Freitak и др. 12. Сообщили максимум 36 филотипов принадлежащих в общей сложности 7 различных видов бактерий в качестве единственных членов сообщества бактерий, связанного с этим насекомым. Кроме того, нет сложной процедурой разведение не требуется для роста насекомых в лаборатории. Кроме того, это и короткий жизненный цикл насекомого облегчить мульти-гenerational исследования, превращая этот вид в идеальном модельной системы для изучения кишка-микробных взаимодействий.
С появлением технологий секвенирования на основе ПЦР, число исследований, посвященных кишки биоты нескольких организмов (т.е. люди, насекомых или морских организмов), увеличилось. Кроме того, результаты не зависят от выделения и культивирования кишечной питал бактерий, как и в прошлом. Почти 99% бактерий не пригодной для обработки и моделирования условий окружающей среды, существующих в кишечнике трудно 12. С помощью ПЦР, 16S рРНК фрагменты генов (широко используемый филогенетическое маркерный ген среди бактерий), могут быть селективно амплифицированы из шаблона смешанной ДНК кишечных бактериальных сообществ, секвенировали и клонировали. С этой информацией, пользователь может определить видов бактерий после получения информации о последовательности из государственных баз данных 13,14. Тем не менее, последовательность подходов для описания бактериальныхобщины остаются недостаточными в связи с отсутствием информации о внутренней метаболической вклада отдельных видов в сообществе.
Стабильный изотоп зондирования (SIP) является перспективным методом культура обслуживания. Он часто используется в экологической микробиологии для анализа микробных филогении связаны с определенными метаболической активности. Это достигается путем отслеживания стабильных изотопов, меченых атомов с субстратов в микробных маркеров, таких как фосфолипидных производных жирных кислот, ДНК и РНК 5. При рассмотрении нуклеиновых кислот, методика основана на разделении 13 C-меченой ДНК или РНК от немеченого ДНК с помощью градиенте плотности ультрацентрифугирования 6. В связи с этим прямой связи между меткой ДНК и метаболической активности, ниже по течению молекулярный анализ нуклеиновых кислот определяет виды и предоставляет информацию о метаболической активности. Кроме того, сочетание ДНК-SIP и пиросеквенирования применительно кPilloni, фон Netzer и соавт. 15, допускает определенную простой и чувствительный идентификации видов бактерий, присутствующих в тяжелой 13 С-меченого ДНК-фракции. До сих пор эта методика была применена для описания бактериальных сообществ, участвующих в биохимических процессов в почве в аэробных 16,17 и анаэробных условиях 18,19. Кроме использования в экологической науки, техника была применена в медицине как сообщает Рейхардта и соавт. 5, который описал метаболические деятельности различных филогенетических групп кишечной микрофлоры человека в ответ на неперевариваемых углеводов.
Здесь мы используем 13 C-глюкозы в 'этикетке "ДНК из метаболически активных видов бактерий в кишечнике. Глюкоза является сахар используется в большинстве видов бактерий вдоль широкого Энтнер-Doudoroff (ЭД) пути, хотя исключения, как известно, 20. Этооправдывает использование 13 С-глюкозы в качестве надежного обмена веществ зонда, который обеспечивает связь между метаболитов, представляющих интерес и источника углерода на существующих путей. В зависимости от научной вопрос, другие субстраты, т.е. 13 C-метана, CO 2 13, или растений, заданным в 13 CO 2 атмосфере, могут быть использованы для решения метаболических действий.
На данный момент, мы представляем протокол применяется в метаболической характеристики кишечной бактериальной общины универсалом насекомого, а именно S. littoralis (Lepidoptera, Совки). Кроме того, техника была соединена с пиросеквенирования, что в свою очередь позволяет идентифицировать насекомых кишечника бактериального сообщества с высоким разрешением и точностью. В качестве основного субстрата, 13 С-меченого глюкозы был использован в ходе экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кишечник большинства насекомых таит в себе богатую и сложную микробное сообщество; обычно 10 7 -10 9 прокариотических клеток подать там, превосходящими собственные клетки хозяина в большинстве случаев. Таким образом, насекомое кишка "горячей точкой" для разнообразных ми?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Angelika Berg для лабораторного помощи. Эта работа была поддержана и финансируется Общества Макса Планка и Йена школе микробной коммуникации (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referenzen
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
