Bezeichnung des metabolisch aktiven Bakterien im Darm der Generalist<em> Spodoptera littoralis</em> Über DNA Stable Isotope Probing Mit<sup> 13</sup> C-Glucose
Summary
Die aktive Bakteriengemeinschaft mit dem Darm von Spodoptera littoralis verbunden sind, wurde von stabilen Isotopen-Probing (SIP) zu Pyrosequenzierung gekoppelt bestimmt. Mit dieser Methode wurde die Identifizierung der metabolisch aktiven Bakterienarten innerhalb der Gemeinde mit hoher Auflösung und Genauigkeit durchgeführt.
Abstract
Guts der meisten Insekten werden durch komplexe Gemeinschaften von symbiotischen Bakterien nicht pathogen bewohnt. Innerhalb dieser mikrobiellen Gemeinschaften ist es möglich, kommen oder mutualistic Bakterienarten identifizieren. Letztere sind beobachtet worden, um mehrere Funktionen zu den Insekten dienen, also hilft in Insekten Wiedergabe ein, die Förderung der Immunantwort 2, Pheromonproduktion 3, sowie Ernährung, einschließlich der Synthese von essentiellen Aminosäuren 4, unter anderem.
Aufgrund der Bedeutung dieser Vereine haben viele Anstrengungen unternommen, um die Gemeinden bis zu den einzelnen Mitgliedern zu charakterisieren. Die meisten dieser Bemühungen wurden entweder auf Kultivierungsmethoden basieren oder auf der Erzeugung von 16S-rRNA-Gen-Fragmente, die für die endgültige Identifizierung sequenziert wurden herangezogen. Leider sind diese Ansätze nur dann erkannt, die in der Darmbakterienarten vorhanden und sofern keine informatIonen auf die metabolische Aktivität der Mikroorganismen.
Die metabolisch aktive Bakterienarten im Darm eines Insekts zu charakterisieren, haben wir stabile Isotop Sondierung (SIP) in vivo Anwendung 13 C-Glucose als universelle Substrat. Dies ist eine vielversprechende Kultur freie Technik, die die Verknüpfung der mikrobiellen Stammbäume ihrer besonderen Stoffwechselaktivität ermöglicht. Dies ist durch die Verfolgung stabilen Isotop markierten Atome von Substraten in mikrobiellen Biomarkern, wie DNA und RNA 5 möglich. Der Einbau von 13 C-Isotope in DNA erhöht die Dichte der markierten DNA im Vergleich zum unmarkierten (12 C) ein. Am Ende wird das 13 C-markierte DNA oder RNA, die durch Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation aus dem 12 C-unmarkierten ähnliches 6 getrennt. Anschließende molekulare Analyse der getrennten Nukleinsäure Isotopologen stellt die Verbindung zwischen der metabolischen Aktivität und der Identität der Spezies.
Hier präsentieren wir die verwendet werden, um die stoffwechselaktiven Bakterien im Darm der Insekten-Generalist (unser Modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae) charakterisieren Protokoll. Die phylogenetische Analyse der DNA wurde mit Pyrosequenzierung, die hohe Auflösung und Genauigkeit bei der Identifizierung von Insektendarmbakteriengemeinschaft erlaubt getan. Als Hauptsubstrat wurde 13 C-markierter Glukose in den Experimenten verwendet. Das Substrat wurde auf die Insekten mit einer künstlichen Nahrung gefüttert.
Introduction
Insekten-Bakterien-Symbiose Verbände sind für eine Vielzahl von Insektenarten 7 bekannt. In diesen symbiotischen Verbände, spielen Mikroorganismen eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung von Insekten. Mikroben haben gezeigt, Insektenreproduktions 1, Pheromonbiosynthese 3, Ernährung, einschließlich der Synthese von essentiellen Aminosäuren 4 und Verdauung von Lebensmitteln ungeeignet zum Host beitragen. Trotz der Vielzahl von gut-Bakterienverbände, viel weniger ist über die funktionelle Rolle, die sie zugunsten des Insekts spielen, bekannt. Nur im Falle der Termiten, die symbiotische Verdauung von Lignocellulose durch Prokaryonten, Protozoen und Pilzen durchgeführt wird, wurde ausführlich untersucht 8,9. Im Gegensatz dazu, ist wenig über die Symbiose im Darm der Insekten Generalist, dh die Baumwollwurms heute bekannten Spodoptera littoralis. Darüber hinaus wurden aufgrund ihrer häufigen Verschiebung der Wirtspflanzen, allgemeineIST Insekten und deren darmassoziierten Bakteriengemeinschaften sind ständig neue Herausforderungen, um ihre Ernährungsgewohnheiten Verbrauchsanlagen mit einer Vielzahl von sekundären Pflanzenstoffen verknüpft ausgesetzt. Daneben ist die Darmumgebung Lepidoptera, stellt an sich eine raue Umgebung für das Wachstum von Bakterien, die wegen der hohen pH 10 gut. Insbesondere in dem Fall von S. littoralis reicht sie von 10,5 in der Vorderdarm, ca.. 9 im Mitteldarm auf fast 7 im Enddarm 11 pH-Wert. Auf der anderen Seite, die bakterielle Gemeinschaft mit dem Darm von S. verbunden littoralis ist einfach. Tang, Freitak, 12 et al. Berichtet maximal 36 Phylotypen auf insgesamt 7 verschiedene Bakterienarten als die einzigen Mitglieder der Bakteriengemeinschaft mit diesem Insekt verbunden gehört. Neben dieser, ist keine komplizierte Aufzuchtverfahren für die Insektenwachstums im Labor erforderlich. Weiterhin dieser und der kurzen Lebenszyklus der Insekten zu erleichtern Multi-generational Studien, drehen diese Art in ein ideales Modellsystem zur Untersuchung der Darm-Mikroben-Interaktionen.
Mit dem Aufkommen der PCR-basierten Sequenzierungstechnologien, ist die Zahl der Studien, die sich mit Darm Biota von mehreren Organismen (dh Menschen, Insekten oder Meeresorganismen) erhöht. Darüber hinaus sind die Ergebnisse aus der Isolation und Kultivierung der Darm beherbergt Bakterien als in der Vergangenheit unabhängig. Fast 99% der Bakterien nicht kultivierbaren und die Simulation der im Darm herrschenden Umweltbedingungen ist schwierig 12. Durch PCR konnte 16S-rRNA-Gen-Fragmenten (ein weit verbreitetes phylogenetische Marker-Gen unter Bakterien) selektiv aus einer gemischten DNA-Matrize der Darmbakteriengemeinschaften, sequenziert amplifiziert, kloniert. Mit diesen Informationen kann der Benutzer die Bakterienspezies nach Erfassen der Sequenzinformation aus öffentlichen Datenbanken 13,14 identifizieren. Dennoch nähert sich die Sequenzierung, um bakterielle beschreibenGemeinden vor unzureichend aufgrund fehlender Informationen über die Stoffwechseleigenbeitrag der einzelnen Arten innerhalb der Gemeinschaft.
Stabil-Isotopen-Probing (SIP) ist ein vielversprechender Kultur-freie Technik. Es wird oft in der Umweltmikrobiologie zur mikrobiellen Stammbäume, um bestimmte Stoffwechselaktivitäten verknüpft analysieren. Dies wird durch das Verfolgen stabilen Isotop markierten Atome von Substraten in mikrobiellen Biomarkern, z. B. Phospholipid-Fettsäuren abgeleitet sind, DNA, RNA und 5 gelöst. Bei der Betrachtung von Nukleinsäuren wird die Methodik bei der Trennung von 13 C-markierter DNA oder RNA aus der unmarkierten DNA durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation 6 basiert. Wegen dieser direkten Verbindung zwischen der DNA-Markierung und die metabolische Aktivität, einem nachgeschalteten molekularen Analyse der Nukleinsäuren identifiziert die Arten und liefert Informationen über Stoffwechselaktivitäten. Außerdem Kombination von DNA-SIP und Pyrosequenzierung durch AnwendungPilloni, von Netzer, et al. 15. ermöglicht eine besonders einfache und sensitive Identifizierung der Bakterienarten in der schweren 13 C-markierten DNA-Fraktion vor. Bisher wurde diese Technik angewandt, um die Bakteriengemeinschaften in biogeochemischen Prozesse im Boden unter aeroben und anaeroben Bedingungen 16,17 18,19 beteiligt zu beschreiben. Neben der Verwendung in der Umweltwissenschaft ist die Technik, die in den medizinischen Wissenschaften angewendet worden, wie durch Reichardt et al. 5, die die Stoffwechselaktivitäten der verschiedenen phylogenetischen Gruppen der menschlichen Darmflora in Reaktion auf ein unverdauliches Kohlenhydrat beschrieben gemeldet.
Hier verwenden wir 13 C-Glucose auf 'label' die DNA der metabolisch aktiven Bakterienarten im Darm. Glucose ist ein Zucker von den meisten Bakterienarten entlang der weit verbreiteten Entner-Doudoroff (ED)-Weg verwendet, obwohl Ausnahmen sind bekannt 20. Diesrechtfertigt den Einsatz von 13 C-Glucose als zuverlässiger Stoffwechsel Sonde, die eine Verbindung zwischen Stoffwechselprodukte von Interesse und der Kohlenstoffquelle entlang etablierten Wege bietet. Je nach wissenschaftlicher Frage andere Substrate, dh 13 C-Methan, 13 CO 2 oder Pflanzen unter einer 13 CO 2-Atmosphäre angehoben ist, kann verwendet werden, um Stoffwechselaktivitäten zu adressieren.
An dieser Stelle, die im Stoffwechsel Charakterisierung der Bakteriengemeinschaft im Darm der Insekten-Generalist, nämlich S. verwendete Protokoll präsentieren wir littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Darüber hinaus wurde das Verfahren auf Pyrosequenzierung, was wiederum ermöglicht die Identifizierung von Insektendarmbakteriengemeinschaften mit hoher Auflösung und Genauigkeit gekoppelt. Als Hauptsubstrat wurde 13 C-markierter Glukose in den Experimenten verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Darm der meisten Insekten beherbergt eine reiche und komplexe mikrobielle Gemeinschaft, in der Regel 10 7 10 9 prokaryotischen Zellen einlegen dort Überzahl der Gastgeber die eigenen Zellen in den meisten Fällen. Somit ist das Insektendarm eine "Hot Spot" für diverse mikrobielle Aktivitäten, die mehrere Aspekte der mikrobiellen Beziehungen, von der Pathogenese zur mutualism 27 verpflichten. Obwohl viele Studien haben eine erstaunliche Vielfalt an Insektendarm mikrobiell…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Angelika Berg für Labor-Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Jena School for Microbial Communication (JSMC) unterstützt und finanziert.
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referenzen
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