La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em> Spodoptera littoralis</em> Vía ADN isótopos estables Uso<sup> 13</sup> C-glucosa
Summary
La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.
Abstract
Tripas de la mayoría de los insectos son habitadas por comunidades complejas de bacterias no patógenas simbióticas. Dentro de estas comunidades microbianas es posible identificar especies comensales o bacterias mutualistas. Estos últimos, se han observado para servir a múltiples funciones para el insecto, es decir, ayudar en la reproducción de insectos 1, reforzar la respuesta inmune 2, la producción de feromonas 3, así como la nutrición, incluyendo la síntesis de los aminoácidos esenciales 4, entre otros.
Debido a la importancia de estas asociaciones, se han hecho muchos esfuerzos para caracterizar las comunidades hacia abajo a los miembros individuales. Sin embargo, la mayoría de estos esfuerzos se basaban en métodos de cultivo o se basó en la generación de fragmentos del gen 16S rRNA que se secuenciaron para la identificación final. Desafortunadamente, estos enfoques sólo identificaron las especies bacterianas presentes en el intestino y no proporcionaron Informatde iones sobre la actividad metabólica de los microorganismos.
Para caracterizar las especies bacterianas metabólicamente activas en el intestino de un insecto, hemos utilizado isótopos estables (SIP) in vivo empleando 13 C-glucosa como un sustrato universal. Esta es una técnica de cultivo libre prometedora que permite la vinculación de las filogenias microbianos para su actividad metabólica particular. Esto es posible mediante el seguimiento, la etiqueta de isótopos de átomos estables a partir de sustratos en biomarcadores microbianos, tales como ADN y ARN 5. La incorporación de isótopos 13 C en el ADN aumenta la densidad de la etiqueta de ADN en comparación con el no marcado (12 C) uno. En el extremo, el ADN marcado con C 13 o de ARN se separaron por ultracentrifugación en gradiente de densidad de la C-12 no marcado uno similar 6. Posterior análisis molecular de los isotopómeros de ácido nucleico separadas proporciona la conexión entre la actividad metabólica y la identidad de las especies.
A continuación, presentamos el protocolo utilizado para caracterizar las bacterias metabólicamente activas en el intestino de un insecto generalista (nuestro modelo de sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). El análisis filogenético del ADN se realizó utilizando la pirosecuenciación, lo que permitió alta resolución y precisión en la identificación de intestino de insecto de la comunidad bacteriana. Como sustrato principal, se utilizó 13 de la glucosa marcado con C en los experimentos. El sustrato se alimenta a los insectos utilizando una dieta artificial.
Introduction
Asociaciones simbióticas Insecto-bacterianas son conocidos por un gran número de especies de insectos 7. En estas asociaciones simbióticas, microorganismos desempeñan papeles importantes en el crecimiento y desarrollo de insectos. Los microbios se han demostrado contribuir a la reproducción de los insectos 1, la biosíntesis de feromona 3, la nutrición, incluyendo la síntesis de los aminoácidos esenciales 4, y la digestión de los alimentos inaccesibles para el anfitrión. A pesar de la gran variedad de asociaciones-intestinal bacteriana, se sabe mucho menos sobre el papel funcional que desempeñan en favor del insecto. Sólo en el caso de las termitas, la digestión simbiótica de lignocelulosa llevada a cabo por los procariotas, protozoos y hongos, ha sido ampliamente estudiado 8,9. En contraste con esto, se sabe poco acerca de la asociación simbiótica presente en el intestino de los insectos generalistas, es decir, la rosquilla negra, Spodoptera littoralis. Por otra parte, debido a su cambio frecuente de los ejércitos de las plantas, en generalist insectos y sus viscerales comunidades bacterianas asociadas están expuestos permanentemente a los nuevos desafíos relacionados con sus hábitos de alimentación que consumen las plantas con una gran cantidad de fitoquímicos. Además de esto, el medio ambiente intestinal en los lepidópteros, representa de por sí un ambiente hostil para el crecimiento de bacterias debido a la alta pH intestinal 10. Particularmente en el caso de S. littoralis, oscila entre 10,5 en el intestino anterior, ca. 9 en el intestino medio a pH casi 7 en el intestino posterior 11. Por otro lado, la comunidad bacteriana asociada con el intestino de S. littoralis es simple. Tang, Freitak, et al 12. Informaron de un máximo de 36 filotipos pertenecientes a un total de 7 especies de bacterias diferentes como los únicos miembros de la comunidad bacteriana asociada a este insecto. Además de esto, no se requiere ningún procedimiento de cría complicado para el crecimiento de los insectos en el laboratorio. Además, este y el corto ciclo de vida del insecto facilitar múltiples gestudios enerational, convirtiendo esta especie en un sistema modelo ideal para el estudio de las interacciones gut-microbio.
Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación basados en la PCR, el número de estudios que se ocupan de la biota intestinal de varios organismos (es decir, los seres humanos, insectos, u organismos marinos) se ha incrementado. Por otra parte, los resultados son independientes de aislamiento y cultivo de las bacterias del intestino albergado como en el pasado. Casi el 99% de las bacterias no son cultivables y la simulación de las condiciones ambientales reinantes en el intestino es difícil 12. Mediante el uso de PCR, 16S rRNA fragmentos de genes (un marcador de gen filogenético ampliamente utilizado entre las bacterias) podrían ser amplificadas selectivamente a partir de una plantilla de ADN mixta de comunidades bacterianas intestinales, secuenciados, y se clonaron. Con esta información, el usuario es capaz de identificar las especies bacterianas después de recuperar la información de la secuencia de bases de datos públicas 13,14. Sin embargo, la secuenciación se acerca a describir bacterianacomunidades siguen siendo insuficientes debido a la falta de información sobre la contribución metabólica intrínseca de las especies individuales dentro de la comunidad.
De isótopos estables de sondeo (SIP) es una técnica de cultivo libre prometedor. A menudo se utiliza en microbiología ambiental para analizar filogenias microbianos vinculados a las actividades metabólicas particulares. Esto se logra mediante el seguimiento, la etiqueta de isótopos de átomos estables a partir de sustratos en biomarcadores microbianos, tales como ácidos grasos de fosfolípidos derivados de, ADN, ARN y 5. Al considerar los ácidos nucleicos, la metodología se basa en la separación de 13 ADN marcado con C o ARN a partir del ADN no marcado por ultracentrifugación en gradiente de densidad 6. Debido a esta conexión directa entre la etiqueta de ADN y la actividad metabólica, un análisis molecular de aguas abajo de los ácidos nucleicos identifica la especie y proporciona información sobre las actividades metabólicas. Por otra parte, la combinación de ADN-SIP y pirosecuenciación tal como se aplica porPilloni, von Netzer, et al. 15, permite una identificación sencilla y sensible particular de las especies de bacterias presentes en la fracción de ADN pesado 13 C-etiquetados. Hasta ahora, esta técnica se ha aplicado para describir las comunidades bacterianas involucradas en los procesos biogeoquímicos en el suelo bajo aeróbicas y anaeróbicas 16,17 18,19 condiciones. Además del uso en las ciencias ambientales, la técnica se ha aplicado en las ciencias médicas según lo informado por Reichardt, et al. 5, que describe las actividades metabólicas de los diferentes grupos filogenéticos de la microbiota intestinal humana en respuesta a un carbohidrato no digerible.
Aquí utilizamos 13 C-glucosa para "etiqueta" el ADN de las especies de bacterias metabólicamente activas en el intestino. La glucosa es un azúcar utilizado por la mayoría de las especies bacterianas a lo largo de la vía de Entner-Doudoroff generalizada (ED), aunque se conocen excepciones 20. Estejustifica el uso de 13 C-glucosa como sonda metabólica confiable que proporciona un vínculo entre los metabolitos de interés y la fuente de carbono a lo largo de las vías establecidas. Dependiendo de la pregunta científica, otros sustratos, es decir, 13 C-metano, 13 CO 2, o plantas cultivadas en una atmósfera de 13 CO 2, se puede utilizar para hacer frente a las actividades metabólicas.
En este punto, se presenta el protocolo utilizado en la caracterización metabólica de la comunidad bacteriana del intestino de un insecto generalista, es decir, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Por otra parte, la técnica se acopló a la pirosecuenciación, que a su vez permite la identificación de la comunidad bacteriana de intestino de insecto con alta resolución y precisión. A medida que el sustrato principal, 13 de glucosa marcada con C se utilizó durante los experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El intestino de la mayoría de los insectos alberga una comunidad microbiana rica y compleja, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas se alojan allí, superando en número a las propias células del huésped en la mayoría de los casos. Por lo tanto, el intestino del insecto es un "punto caliente" para diversas actividades microbianas, que representa múltiples aspectos de las relaciones de microbios, de patogénesis obligar mutualismo 27. Aunque muchos estudios han descrit…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Angelika Berg para la asistencia de laboratorio. Este trabajo fue apoyado y financiado por la Sociedad Max Planck y la Escuela de Jena para Microbiana Comunicación (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referenzen
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