Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell'intestino del generalista<em> Spodoptera littoralis</em> Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup> 13</sup> C-glucosio
Summary
La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.
Abstract
Guts della maggior parte degli insetti sono abitate da comunità complesse di batteri non patogeni simbiotici. All'interno di queste comunità microbiche è possibile identificare commensali o batteri mutualistiche specie. Questi ultimi, sono stati osservati per servire molteplici funzioni per l'insetto, ossia ad assistere nella riproduzione insetto 1, stimolare la risposta immunitaria 2, produzione feromone 3, così come la nutrizione, tra cui la sintesi di amminoacidi essenziali 4, tra gli altri.
Data l'importanza di queste associazioni, sono stati fatti molti sforzi per caratterizzare le comunità fino ai singoli membri. Tuttavia, la maggior parte di questi sforzi sono stati entrambi basati su metodi di coltivazione o invocato la generazione di frammenti del gene 16S rRNA che sono stati sequenziati per l'identificazione finale. Purtroppo, questi approcci solo individuate le specie batteriche presenti nell'intestino e non hanno fornito alcuna informatione sull'attività metabolica dei microrganismi.
Per caratterizzare le specie batteriche metabolicamente attive nell'intestino di un insetto, abbiamo usato isotopo stabile tastatura (SIP) in vivo impiegando 13 C-glucosio come substrato universale. Questa è una tecnica priva di cultura promettente che permette il collegamento di filogenesi microbica per la loro particolare attività metabolica. Ciò è possibile inseguimento stabili, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, come DNA e RNA 5. L'incorporazione di 13 C isotopi nel DNA aumenta la densità del DNA marcato rispetto al non marcato (12 C) uno. Alla fine, il DNA 13 C-marcato o RNA è separato mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità del 12 C-marcato una simile 6. La successiva analisi molecolare dei isotopomeri separati acidi nucleici fornisce il collegamento tra l'attività metabolica e l'identità delle specie.
Qui vi presentiamo il protocollo utilizzato per caratterizzare i batteri metabolicamente attivi nell'intestino di un insetto generalista (il nostro modello di sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L'analisi filogenetica del DNA è stata effettuata usando pyrosequencing, che ha permesso alta risoluzione e precisione nell'identificazione del budello insetto comunità batterica. Come substrato principale, 13 C-glucosio marcato è stato usato negli esperimenti. Il substrato è stato alimentato agli insetti con una dieta artificiale.
Introduction
Associazioni simbiotiche Insect-batteriche sono conosciute per un gran numero di specie di insetti 7. In queste associazioni simbiotiche, i microrganismi svolgono un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo di insetti. I microbi hanno dimostrato di contribuire alla riproduzione insetto 1, feromone biosintesi 3, alimentazione, compresa la sintesi di amminoacidi essenziali 4, e la digestione del cibo inaccessibili all'host. Nonostante la grande varietà di associazioni gut-batterica, tanto meno si sa circa il ruolo funzionale che svolgono a favore degli insetti. Solo in caso di termiti, la digestione simbiotico di lignocellulosa effettuata da procarioti, protozoi e funghi, è stata ampiamente studiata 8,9. In contrasto con questo, poco si sa circa l'associazione simbiotica presente nell'intestino degli insetti generalisti cioè il leafworm cotone, Spodoptera littoralis. Inoltre, a causa del loro spostamento frequente di piante ospiti, generaleTSI insetti e loro intestino comunità batteriche associate sono esposti in modo permanente alle nuove sfide legate alle loro abitudini alimentari consumando piante con una pletora di sostanze fitochimiche. Oltre a questo, l'ambiente intestinale in lepidotteri, costituisce di per sé un ambiente difficile per la crescita di batteri causa della elevata budello pH 10. In particolare nel caso di S. littoralis, si va dal 10,5 al foregut, ca. 9 nella midgut a pH quasi 7 nella hindgut 11. D'altra parte, la comunità batterica associata con l'intestino di S. littoralis è semplice. Tang, Freitak, et al. 12 hanno riportato un massimo di 36 filotipi appartenenti ad un totale di 7 diverse specie batteriche come unici membri della comunità batterica associata a questo insetto. Oltre a questo, non complicata procedura allevamento è necessaria per la crescita degli insetti in laboratorio. Inoltre, questo e il breve ciclo di vita dell'insetto facilitare multi-gstudi enerational, trasformando questa specie in un sistema modello ideale per lo studio delle interazioni gut-microbo.
Con l'avvento delle tecnologie di sequenziamento basate sulla PCR, il numero di studi che si occupano di budello biota di diversi organismi (cioè esseri umani, insetti o organismi marini) è aumentata. Inoltre, i risultati sono indipendenti da isolamento e la coltura dei batteri intestinali nutrito come in passato. Quasi il 99% dei batteri non sono coltivabili e la simulazione delle condizioni ambientali prevalenti nell'intestino è difficile 12. Utilizzando PCR, 16S rRNA frammenti di geni (un gene marcatore filogenetico ampiamente utilizzato tra i batteri) potrebbero essere selettivamente amplificati da un modello di DNA misto di comunità batteriche intestinali, sequenziati e clonati. Con queste informazioni, l'utente è in grado di identificare le specie batteriche dopo aver recuperato le informazioni sulla sequenza da database pubblici 13,14. Tuttavia, la sequenza si avvicina a descrivere battericacomunità rimangono insufficienti a causa della mancanza di informazioni sul contributo metabolica intrinseca delle singole specie all'interno della comunità.
Stabile-isotopo sondaggio (SIP) è una tecnica priva di cultura promettente. E 'spesso utilizzato in microbiologia ambientale per analizzare filogenesi microbica legati a particolari attività metaboliche. Ciò si ottiene usando stable, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, quali acidi grassi derivati da fosfolipidi, DNA e RNA 5. Quando si considera acidi nucleici, la metodologia è basata sulla separazione di 13 C-marcato DNA o RNA dal DNA non marcato dal gradiente di densità ultracentrifugazione 6. A causa di questa connessione diretta tra l'etichetta DNA e l'attività metabolica, un'analisi molecolare a valle degli acidi nucleici individua le specie e fornisce informazioni sulle attività metaboliche. Inoltre, la combinazione di DNA-SIP e pyrosequencing come applicato dallaPilloni, von Netzer, et al. 15, permette una particolare identificazione semplice e sensibile delle specie batteriche presenti nella frazione DNA pesante 13 C-marcato. Fino ad ora, questa tecnica è stata applicata per descrivere le comunità batteriche coinvolte in processi biochimici nel terreno sotto 16,17 aerobiche e anaerobiche condizioni 18,19. Oltre all'uso in scienze ambientali, la tecnica è stata applicata per la medicina come riportato da Reichardt, et al. 5, che descrive le attività metaboliche dei diversi gruppi filogenetici del microbiota intestinale umano in risposta ad un carboidrato nondigestible.
Qui usiamo 13 C-glucosio di 'label' il DNA delle specie batteriche metabolicamente attivi nell'intestino. Il glucosio è uno zucchero utilizzato dalla maggior parte delle specie batteriche lungo la diffusa Entner-Doudoroff (ED) percorso, anche se le eccezioni sono noti 20. Questogiustifica l'utilizzo di 13 C-glucosio come sonda metabolico affidabile che fornisce un collegamento tra metaboliti di interesse e la fonte di carbonio lungo percorsi stabiliti. A seconda della domanda scientifica, altri substrati, cioè 13 C-metano, 13 CO 2, o piante ottenute sotto atmosfera di 13 CO 2, può essere utilizzato per affrontare attività metaboliche.
A questo punto, presentiamo il protocollo applicato nella caratterizzazione metabolica della comunità batterica intestinale di un insetto generalista, cioè S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Inoltre, la tecnica è stata accoppiata con pyrosequencing, che a sua volta permette l'identificazione di insetto comunità batterica intestinale con alta risoluzione e precisione. Come substrato principale, 13 C-glucosio marcato è stato utilizzato durante gli esperimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'intestino della maggior parte degli insetti ospita una comunità microbica ricco e complesso, in genere 10 7 -10 9 cellule procariote alloggiano lì, superando in numero le cellule dell'ospite nella maggior parte dei casi. Così, l'intestino insetto è un "hot spot" per diverse attività microbiche, che rappresenta molteplici aspetti delle relazioni microbici, da patogenesi di obbligare mutualismo 27. Anche se molti studi hanno descritto una straordinaria varietà…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Angelika Berg per l'assistenza di laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto e finanziato dalla Max Planck Society e la Scuola di Jena per microbica Communication (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referenzen
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