一个<em>体外</em>企业文化系统来研究甲状腺发展
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
甲状腺是一个bilobated内分泌腺定位在颈部的基部，产生甲状腺激素T3，T4，和降钙素。 T3和T4是由区别的甲状腺细胞，组织在封闭的球体称为卵泡产生的，而降钙素是由C-细胞，穿插在卵泡和密集的网络毛细血管之间的合成。虽然成人甲状腺结构和功能已被广泛地描述和研究，对“血管滤泡”单位，C-细胞在软组织的分布和上皮细胞和内皮细胞之间的旁分泌通信的形成远未了解。
这种方法描述了semiporous过滤器或显微镜塑料滑梯的连续步骤的小鼠胚胎甲状腺原基剥离和它的文化。在为期四天，这个文化系统忠实地概括体内甲状腺发展。事实上，（ⅰ）亿的脏器obation发生时（E12.5植），（ⅱ）前体甲状腺组织成毛囊和极化，（ⅲ）甲状腺细胞和C-细胞分化，以及（iv）中存在的显微组织增殖的内皮细胞，迁移到甲状腺叶，并紧密地与上皮细胞联系起来，因为他们在体内 。
甲状腺组织可以从野生型，基因敲除或荧光转基因胚胎获得。此外，外植体培养可以通过添加抑制剂被操纵，阻断抗体，生长因子，或什至细胞或条件培养基。 体外发育可以实时进行分析，或在培养的任何时间，通过免疫染色和RT-qPCR的。
总之，甲状腺外植体培养结合下游全贴或部分成像和基因表达分析提供了强大的系统，用于操纵和研究甲状腺邻形态发生和分化活动rganogenesis。
Introduction
甲状腺是独立的上皮领域的集合，称为卵泡，通过密集的网络毛细血管内皮细胞所包围。该组织允许甲状腺功能：毛细血管内皮提供甲状腺与碘，所需的T3和T4激素的合成，并分发这些后期到全身。散落在毛囊和毛细血管之间，C-细胞产生的低血钙激素降钙素1。虽然成人甲状腺结构和功能是众所周知的，参与甲状腺胚胎发育（卵泡形成和分化）的细胞和分子机制远未清楚。
在胚胎发育，甲状腺祖起源的前肠内胚层的腹壁在胚胎一天增厚（中线原基）（e）在小鼠胚胎8.5，而C-细胞祖细胞起源于E11.5为液滴状突起（在鳃博死亡的第四咽囊2-6）。中线芽然后从内胚层分离，扩大双边在E13.5融合与气管两侧的鳃组织。最后，甲状腺组织到毛囊和C-细胞分化。
甲状腺形成目前的知识主要来自固定的组织的组织学分析，但涉及甲状腺形成的形态发生的事件是高度动态的，并涉及不同的细胞类型之间以及与细胞外基质的通信和交互。最近的工作表明，甲状腺细胞祖细胞产生高水平的VEGF招募内皮细胞向显影甲状腺，并且，反过来，招募了内皮细胞的促滤泡形成和C-细胞分化7。
大多数体外研究对甲状腺孤立成人甲状腺来源的细胞已被执行，无论是种植在二维组织培养塑料ðishes或3D矩阵。使用这些类型的文化，差异化的滤泡细胞要么保持极化和组织为毛囊或重新获取三维组织8-10。然而，这些纯上皮细胞，由它们的生理环境中取出的，并且在二维培养，忽略与细胞外基质，细胞因子，生长因子和其它细胞类型，如内皮细胞或神经细胞，它们在体内 ，通常遇到的相互作用。一个很漂亮的研究最近描述了胚胎干细胞分化成的协议使用3D基质胶11的最终培养步骤甲状腺滤泡。然而，这些3D的文化缺乏与其他类型的细胞接触。
根据以往的专业知识对胰腺和唾液腺器官培养12-14，解剖小鼠胚胎甲状腺原基和培养上semiporous过滤器或显微镜塑料滑梯外植体的方法被开发了。
何时与E12.5胚胎工作时，甲状腺原基（中线原基和两个侧鳃体）的双重起源组织所施加的大片段的显微解剖。这包含在气管，但不是食道，并从咽弓的动脉到杓状肿胀延长。当培养于过滤器时，中线原基横向延伸的气管的每一侧，在那里它们与鳃体融合形成两个甲状腺瓣，通过一个狭窄的峡部仍然连接。
在文化方面，上皮细胞增生，组织成毛囊和分化为甲状腺细胞和C-细胞，这取决于它们的起源。包含在显微组织的内皮细胞也增殖和侵入甲状腺瓣到最后与上皮滤泡结构独立地血液流动或循环的因素，密切关联。为外植体的发展忠实地概括在体内发展换货，这种文化系统是最佳的学习形态和甲状腺发育过程中出现的分化事件。
甲状腺组织可以从野生型，基因敲除或荧光转基因胚胎获得，并且该培养系统是服从损耗和增益函数的实验。最后，在显微镜塑料菜荧光标记的甲状腺植时间推移成像可能被利用来更好地调查发生在体内的动力学和形态发生的动作的连续性。时间推移成像已被用于研究胰腺15,16或输尿管芽17的分支形态。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了解剖，并以研究，更好地了解复杂的事件，导致甲状腺生成甲状腺培养外植体（E12.5）或叶（E14.5）的方法。由于甲状腺原基（中线原基和两个侧鳃体），和它们的小尺寸，E12.5组织局部喙向咽弓的动脉的片段，以及含有该气管，但不是食道的双重原点是显微切割。如图所示，为期四天之内，这种文化系统忠实地概括体内甲状腺的发展，因为：（i）本中线原基迁移双边和膨胀形成…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
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