Ein<em> Ex-vivo-</em> Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
Die Schilddrüse ist eine endokrine Drüse bilobated an der Basis des Halses lokalisiert ist, die Herstellung der Schilddrüsenhormone T3, T4 und Calcitonin. T3 und T4 werden durch differenzierte Thyreozyten, in geschlossenen Bereichen genannt Follikel organisiert produziert, während Calcitonin wird von C-Zellen, zwischen den Follikel und ein dichtes Netz von Blutkapillaren durchsetzt synthetisiert. Obwohl erwachsenen Schilddrüsen Architektur und Funktionen sind ausführlich beschrieben und untersucht, ist die Bildung der "Angio-follikuläre"-Einheiten, die Verteilung der C-Zellen im Parenchym und den parakrinen Kommunikationen zwischen Epithel-und Endothelzellen bei weitem noch nicht verstanden.
Diese Methode beschreibt die aufeinanderfolgenden Schritte embryonalen Maus-anlagen Schilddrüsen Dissektion und seine Kultur auf semiporöse Filter oder Mikroskopie Kunststoff-Objektträger. Innerhalb einer Frist von vier Tagen treu rekapituliert diese Kultursystem in vivo Schilddrüsenentwicklung. In der Tat, (i) Mrd.obation der Orgel auftritt (E12.5 Explantate), (ii) Thyrozyten Vorstufen in Follikel zu organisieren und zu polarisieren, (iii) Thyrozyten und C-Zellen differenzieren, und (iv) in der mikrodissezierten Gewebe vermehren vorhanden Endothelzellen, wandern in die Schilddrüsenlappen, und eine enge Verbindung mit den Epithelzellen, wie sie in vivo zu tun.
Schilddrüsengewebe von Wildtyp-Knockout-oder Fluoreszenz transgenen Embryonen gewonnen werden. Außerdem Explantate Kultur durch Zugabe von Inhibitoren manipuliert werden blockierende Antikörper, Wachstumsfaktoren oder Zellen oder konditioniertes Medium. Ex-vivo-Entwicklung in Echtzeit analysiert werden, oder zu jeder Zeit des Kultur durch Immunfärbung und RT-qPCR.
Abschließend Schilddrüsen Explantatkultur kombiniert mit nachgeschalteter Vollmontage oder auf Abschnitte Imaging-und Genexpressionsprofilen bietet ein leistungsfähiges System für die Manipulation und das Studium morphogenetischen Ereignisse und Differenzierung von Schilddrüsen organogenesis.
Introduction
Die Schilddrüse ist eine Sammlung von unabhängigen epithelialen Kugeln, genannt Follikel, von einem dichten Netz von endothelialen Kapillaren umgeben. Diese Organisation ermöglicht die Funktion der Schilddrüse: endothelialen Kapillaren bieten Thyrozyten mit Jod, für T3-und T4-Hormon-Synthese benötigt und verteilen die letzteren auf den gesamten Körper. Zwischen den Follikeln und Kapillaren verstreut, C-Zellen produzieren das Hormon Calcitonin hypocalcämische ein. Obwohl Erwachsenen Schilddrüsen Architektur und Funktionen bekannt sind, sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Schilddrüsen embryonalen Entwicklung (Follikel Bildung und Differenzierung) beteiligt lange nicht verstanden.
Während der Embryogenese Thyrozyten Vorläufer stammt als Verdickungs (die Mittellinie anlage) der ventralen Wand des Vorderdarmes Entoderm an embryonalen Tag (e) 8,5 im Maus-Embryo, während die C-Zellen Vorläuferzellen entstehen an E11.5 als tropfenförmigen Vorsprünge ( die ultimobranchialen bostirbt) der vierten Schlundtasche 2-6. Die Mittellinie Knospe steht dann aus dem Endoderm, dehnt bilateral an E13.5 den ultimobranchialen Körper auf jeder Seite der Luftröhre zu verschmelzen. Schließlich Thyrozyten in Follikel organisieren und C-Zellen zu differenzieren.
Aktuelle Erkenntnisse über die Bildung der Schilddrüse kommt hauptsächlich aus histologische Analyse von festen Geweben, aber die morphogenetischen Ereignisse in der Schilddrüse Bildung beteiligt sind sehr dynamisch und beinhalten Kommunikation und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen und mit der extrazellulären Matrix. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass thyrocyte Vorläuferzellen produzieren hohe VEGF an Endothelzellen auf die Entwicklung der Schilddrüse zu rekrutieren, und wiederum rekrutiert Endothelzellen zu fördern Follikel Bildung und C-Zellen Differenzierung 7.
Die meisten Ex-vivo-Studien an der Schilddrüse haben auf isolierte Erwachsenen Schilddrüsen-abgeleiteten Zellen entweder auf 2D-Gewebekultur-Plastik d durchgeführt wurde, gewachsenPfarreien oder in 3D-Matrizen. Mit dieser Art von Kulturen, differenzierten follikulären Zellen entweder bleiben polarisiert und als Follikel organisiert oder Wiedererlangung einer 3D-Organisation 8-10. Allerdings sind diese reinen Epithelzellen, aus ihrer physiologischen Umgebung explantiert und in 2D kultiviert, ignorieren Interaktionen mit der extrazellulären Matrix, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderen Zelltypen, wie die Endothel-oder Nerven-Zellen, die sie normalerweise in vivo auftreten. Eine sehr schöne Studie kürzlich eine Differenzierungsprotokoll von ES-Zellen in der Schilddrüse Follikel mit einem abschließenden Kulturschritt in 3D Matrigel 11. Allerdings sind diese 3D-Kulturen fehlen Kontakt mit anderen Zelltypen.
Basierend auf früheren Fachwissen auf Pankreas-und Speicheldrüsen-Organkultur 12-14, ein Verfahren zum Präparieren von embryonalen Maus Schilddrüsen anlagen und Kultivierung der Explantate auf semiporösen Filtern oder Kunststoff-Objektträger für die Mikroskopie entwickelt.
WannArbeiten mit E12.5 Embryonen, die doppelte Herkunft der Schilddrüse anlagen (die Mittellinie anlage und die beiden seitlichen ultimobranchialen Körper) verhängten die Mikrodissektion eines großen Fragments von Gewebe. Dieser enthielt die Luftröhre, aber nicht die Speiseröhre und der Pharyngealbogen Arterien bis zum arytenoid Schwellung verlängert. Wenn auf Filtern kultiviert, erstreckt sich die Mittellinie Anlage seitlich an jeder Seite der Luftröhre, wo sie verschmelzen mit den ultimobranchialen Einrichtungen, um die beiden Schilddrüsenlappen, noch durch einen schmalen Isthmus verbunden sind, bilden.
In der Kultur-, Epithel-Zellen vermehren, organisieren in Follikel und differenzieren sich in Thyrozyten und C-Zellen, je nach Herkunft. Endothelzellen in der mikrodissezierten Gewebe enthielt auch vermehren und dringen in die Schilddrüsenlappen, um schließlich in eine enge Verbindung mit der epithelialen follikulären Struktur, unabhängig von den Blutfluss oder zirkulierende Faktoren. Da die Entwicklung der Explantate treu rekapituliert in vivo entwickelnment, ist dieses Kultursystem optimal und Differenzierung morphogenetischen Ereignisse während der Entwicklung der Schilddrüse auftreten studieren.
Schilddrüsengewebe von Wildtyp-Knockout-oder Fluoreszenz transgenen Embryonen gewonnen werden, und die Kultursystem zugänglich ist Verlust-und Gain-of-function-Experimente. Schließlich könnte Zeitraffer-Imaging von fluoreszenzmarkierten Schilddrüsen Explantate auf Mikroskopie Plastikschalen genutzt werden, um besser zu untersuchen, die Kinetik und die Kontinuität der morphogenetischen Bewegungen, die in vivo auftreten. Zeitraffer-Bildgebung hat bereits zur Verzweigung Morphogenese der Bauchspeicheldrüse oder 15,16 Ureterknospe 17 studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt ein Verfahren zum Präparieren und Kultivieren der Schilddrüse Explantate (E12.5) oder Lappen (E14.5), um zu studieren und ein besseres Verständnis der komplexen Ereignisse, die zur Bildung der Schilddrüse. Aufgrund der dualen Ursprungs der Schilddrüse Anlagen (die Mittellinie Anlage und die beiden seitlichen Körper ultimobranchialen) und ihrer geringen Größe, ein Fragment von E12.5 Gewebe lokalisiert rostral Schlundbogenarterien und die das Luft-, aber nicht die Speiseröhre mikrodissekt…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
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