アン<em>生体外</em甲状腺の開発を研究する>文化システム

Summary

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Abstract

甲状腺は、甲状腺ホルモンT3、T4、およびカルシトニンの生産、首の付け根に局在bilobated内分泌腺である。カルシトニンは、卵胞及び毛細血管の密なネットワークとの間に散在C-細胞により合成されている間T3及びT4は、毛包と呼ばれる閉じた球に編成分化甲状腺細胞によって産生される。成人甲状腺アーキテクチャおよび機能は、広範に記載され、研究されてきたが、「アンギオ濾胞」単位、実質におけるC-細胞の分布および上皮および内皮細胞間のパラクリン通信の形成ははるかに理解されるからである。

この方法は、半多孔フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上のマウス胚性甲状腺原基の解剖とその文化の連続的なステップを説明します。 4日間の期間内に、この培養系は、忠実にインビボ甲状腺開発に再現する。確かに、（I）億臓器のobation（II）の前駆体は卵胞に整理し、分極、（III）甲状腺細胞およびC細胞が分化甲状腺細胞、及び（iv）顕微解剖した組織が増殖に存在する内皮細胞が、中に移動し、（E12.5外植片の場合）が発生密接に甲状腺ローブ、彼らは生体内でそうであるように、上皮細胞に関連付ける。

甲状腺組織は、野生型、または蛍光ノックアウトトランスジェニック胚から得ることができる。さらに、培養物は、抗体、成長因子、または細胞または馴化培地を遮断、阻害剤を添加することによって操作することができる植片。 エクスビボ開発は、リアルタイムで、または培養の任意の時点で免疫染色およびRT-qPCRにより分析することができる。

結論として、下流のホールマウントでまたはセクションイメージングと遺伝子発現プロファイリングに合わせて甲状腺移植片培養は甲状腺Oの形態形成と分化のイベントを操作し、研究するための強力なシステムを提供していますrganogenesis。

Introduction

甲状腺は、内皮毛細血管の密なネットワークに囲まれた毛包と呼ばれる独立した上皮の球を集め、、です。この組織は、甲状腺機能ができます：内皮毛細血管はT3とT4ホル​​モン合成に必要なヨウ素と甲状腺細胞を、提供し、全身に後者を配布します。卵胞と毛細血管の間に散在し、C細胞は、低カルシウム血症ホルモンカルシトニン^1を生産する。成人甲状腺アーキテクチャと機能はよく知られているが、甲状腺胚発生（卵胞形成および分化）に関与する細胞および分子メカニズムははるかに理解されるからである。

胚発生の間に、（C細胞の前駆細胞が滴状突起としてE11.5で発信しながら、先祖は、胎生（E）は、マウス胚における8.5で腸内胚葉の腹側の壁の肥厚（正中原基）として開始甲状腺細胞鰓BO第咽頭袋^2-6のダイ）。正中芽はその後、内胚葉から切り離し気管の両側の鰓後体にE13.5で融合する二国間拡張されます。最後に、甲状腺細胞は、毛包に整理して、C-細胞が分化する。

甲状腺形成に関する現在の知識は、主に固定組織の組織学的分析から来ているが、甲状腺形成に関与する形態形成のイベントは非常に動的であり、異なる細胞種間および細胞外マトリックスとの通信との相互作用を伴う。最近の研究は甲状腺細胞の前駆細胞を開発し、甲状腺への内皮細胞を補充するための高レベルのVEGFを生産し、今度は、内皮細胞は毛包の形成を促進し、C細胞分化⁷募集していることを示した。

甲状腺に最もex vivoでの研究では、どちらかの2D組織培養プラスチックdに成長し、孤立した成人の甲状腺由来の細胞で行われてきたishesまたは3Dマトリックス中。文化のこれらのタイプの分化した細胞濾胞偏光したままと卵胞として組織化や3D組織^8月10日の再取得のいずれかを使用して。しかしながら、それらの生理学的環境から外植し、2Dで培養されたこれらの純粋な上皮細胞は、細胞外基質、サイトカイン、成長因子、それらがインビボで通常遭遇するような内皮細胞または神経細胞などの他の細胞型との相互作用を無視する。非常に素晴らしい研究は、最近、3Dマトリゲル¹¹における最終培養工程を用いて、甲状腺濾胞内にES細胞の分化プロトコルを記載した。しかしながら、これらの3D培養物は、他の細胞型との接触を欠いている。

膵臓および唾液に、前の専門知識に基づいて器官培養^12-14腺、マウス胚性甲状腺原基を解剖し、半多孔フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上植片を培養する方法が開発されました。

時E12.5胚での作業、甲状腺原基（正中原基および2横鰓後体）の二重の起源は、組織の大きなフラグメントのマイクロダイセクションを課した。これは気管ではなく食道を含有し、披裂腫れまでの咽頭弓の動脈から延長した。フィルター上に培養した場合、正中原基は、それらがまだ狭い狭部によって接続された2つの甲状腺ローブを形成し、鰓体と融合気管の各側に横方向に延びている。

文化では、上皮細胞が増殖し、毛包に整理し、その起源に応じて、甲状腺細胞およびC細胞に分化する。マイクロダイセクション組織に含まれる内皮細胞は、増殖し、最終的には独立して血液の流れや循環要因の上皮濾胞構造と密接に関連付けるために、甲状腺葉に侵入。外植片の開発は、忠実に開発し、生体内で再現するようにMENTは、この培養系は、甲状腺の開発中に発生する形態形成と分化事象を研究することが最適である。

甲状腺組織は、野生型、または蛍光ノックアウトトランスジェニック胚から得ることができ、培養系は、損失および機能獲得実験に適している。最終的には、顕微鏡のプラスチック皿上で蛍光標識した甲状腺外植片のタイムラプスイメージングは、より良い生体内で起こる反応速度と形態形成の動きの連続性を調査するために悪用される可能性があります。タイムラプスイメージングは既に膵臓^15,16または尿管芽¹⁷の分岐形態形成を研究するために使用されています。

Protocol

マウスは大学動物福祉委員会の実験動物ケアの原則に従って上昇し、処理した。すべての手順およびプロトコルは、この委員会によって承認された。 1。顕微鏡プラスティックカルチャーチェンバースのコーティング注：層流フード内で無菌条件下で、以下のすべての手順を実行します。コー​​ティングの2種類が、機能的に同等です。 甲?…

Representative Results

甲状腺anlages（一緒に周囲の組織との正中線とUB）、および甲状腺葉（ 図1）は、それぞれ、E12.5およびe13.5/e14.5でマウス胚から解剖されています。フィルター上の文化の中で1日を過ごした後、正中原基は、気管の上に及ぶ細長い組織として（ 図2A）に表示されます。それは徐々に気管の各側に2つのローブを形成する。単離された甲状腺ローブ（E13.5又はE14.5）が培養さ…

Discussion

本論文では、解剖や甲状腺形成につながる複雑な事象を研究し、よりよく理解するために、甲状腺の外植片（E12.5）または葉（E14.5）を培養するための方法を説明します。原因甲状腺原基（正中原基および2横鰓後体）の二重の起源、そしてその小さなサイズ、咽頭弓動脈に吻側にローカライズされたE12.5組織の断片、および気管を含む、ではなく食道へ顕微解剖されています。図示のように、…

Materials

µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile	proxylab	80826
Collagen Type I, rat tail	Millipore	08-115
Fibronectin from human plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Tungsten wire	Goodfellow	LS237450
culture plate insert (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261