<em> Ex vivo</em> מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
בלוטת התריס היא בלוטה האנדוקרינית bilobated המקומית בבסיס הצוואר, ייצור הורמוני בלוטת התריס T3, T4, וקלציטונין. T3 ו-T4 מיוצרים על ידי thyrocytes המובחן, שאורגן בתחומים סגורים הנקראים זקיקים, בעוד קלציטונין הוא מסונתז על ידי C-תאים, וביניהם בין הזקיקים ורשת צפופה של נימי דם. למרות שארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות כבר מתוארים בהרחבה ולמדו, היווצרות של היחידות "Angio-פוליקולרית", ההפצה של C-תאים בparenchyma והתקשורת אוטוקריני בין האפיתל ותאי האנדותל היא רחוק מלהיות מובן.
שיטה זו מתארת את השלבים רציפים של נתיחת עכבר בלוטת התריס עוברית anlagen ותרבותה על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית. בתוך פרק זמן של ארבעה ימים, מערכת זו התרבות בנאמנות משחזרת בהתפתחות בלוטת התריס vivo. ואכן, מיליארדים (i)obation של האיבר מתרחש (לexplants E12.5), (ii) thyrocytes מבשרים לארגן לתוך זקיקים ולקטב, (iii) thyrocytes ו-C-תאים להבדיל, וכן (iv) בתאי האנדותל הנמצאים ברקמה להתרבות microdissected, נודדים לתוך אונות של בלוטת התריס, ושיתוף הפעולה הדוק לקשר עם תאי אפיתל, כפי שהם עושים בגוף חי.
ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון. יתר על כן, explants תרבות ניתן להשפיע על ידי תוספת של מעכבים, חסימת נוגדנים, גורמי גדילה, או אפילו תאים או בינוניים מותנה. Ex vivo פיתוח ניתן לנתח בזמן אמת, או בכל עת של התרבות על ידי immunostaining וRT-qPCR.
לסיכום, התרבות explant בלוטת התריס בשילוב עם כל הר במורד הזרם או בפרופילי הדמיה סעיפים וביטוי גנים מספק מערכת רבת עוצמה עבור מניפולציה ולומד אירועי morphogenetic ובידול של o בלוטת התריסrganogenesis.
Introduction
בלוטת התריס היא אוסף של תחומים אפיתל עצמאיים, המכונה זקיקים, מוקף רשת צפופה של נימי דם אנדותל. ארגון זה מאפשר תפקוד בלוטת התריס: נימי אנדותל לספק thyrocytes עם יוד, הנדרש לסינתזת הורמון T3 ו-T4, ולהפיץ את אלה האחרונים לכל הגוף. מפוזר בין הזקיקים ונימי הדם, C-תאים לייצר את הורמון hypocalcemic calcitonin 1. למרות שהארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות ידועות, המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בהתפתחות בלוטת התריס עוברית (היווצרות זקיק ובידול) הם רחוקים מלהיות מובן.
במהלך עובר, thyrocytes אב מקורו כעיבוי (anlage קו האמצע) של קיר הגחון של האנדודרם המעי הקדמי ביום עוברי (ה) 8.5 בעובר של העכבר, ואילו אבות C-תאים שמקורם בE11.5 כבליטות דמוי טיפה ( bo ultimobranchialמת) של שקיות בלוע הרביעית 2-6. ניצן קו האמצע ואז מתנתק מהאנדודרם, מרחיב בילטרלי הפתיל בE13.5 עם גופי ultimobranchial בכל צד של קנה הנשימה. לבסוף, thyrocytes לארגן לתוך זקיקים ו-C-תאים להתמיין.
ידע הנוכחי על היווצרות בלוטת התריס בעיקר מגיע מניתוח היסטולוגית של רקמות קבועות, אבל אירועי morphogenetic המעורבים בהיווצרות בלוטת התריס הם דינמיים מאוד וכרוכים בתקשורת ויחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים ועם מטריקס. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אבות thyrocyte לייצר רמות גבוהות של VEGF לגייס תאי האנדותל לבלוטת התריס מתפתח, ו, בתורו, גייסו את תאי האנדותל לקדם היווצרות זקיק והתמיינות תאי C-7.
רוב מחקרי vivo לשעבר בבלוטת התריס בוצעו על תאי שמקורם בבלוטת תריס למבוגרים מבודדים, גדלו גם על ד פלסטיק תרבית רקמת 2Dishes או במטריצות 3D. שימוש בסוגים אלה של תרבויות, תאי זקיקי הבדיל או יישארו מקוטב ומאורגן כמו זקיקים או לרכוש מחדש ארגון 3D 8-10. עם זאת, תאים אלו טהורים אפיתל, explanted מהסביבה הפיזיולוגית שלהם, ותרבותיים ב2D, להתעלם מאינטראקציות עם מטריצה תאית, ציטוקינים, גורמי גדילה ועם סוגי תאים אחרים, כמו תאי האנדותל או עצבים שהם בדרך כלל נתקלים בגוף חי. מחקר נחמד מאוד לאחרונה תאר פרוטוקול התמיינות של תאי גזע עובריים לזקיקי בלוטת התריס באמצעות צעד תרבות סופי בmatrigel 3D 11. עם זאת, תרבויות 3D אלה חוסר מגע עם סוגי תאים אחרים.
בהתבסס על המומחיות קודמת בלבלב ובלוטות רוק תרבות איבר 12-14, שיטה לנתח anlagen בלוטת התריס העוברי של העכברים וculturing explants על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית פותחה.
כאשרעבודה עם עוברי E12.5, המקור הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני גופי ultimobranchial לרוחב) שהוטל microdissection של שבר גדול של רקמה. זה הכיל את קנה הנשימה, אבל לא את הוושט, והוארך מעורקי קשת בלוע עד נפיחות arytenoid. כאשר בתרבית על מסננים, anlage קו האמצע משתרע רוחבי בכל צד של קנה הנשימה, שבו הם מתמזגים עם גופי ultimobranchial כדי ליצור את אונות בלוטת התריס שתיים, עדיין מחוברים על ידי מצר צר.
בתרבות, בתאי אפיתל להתרבות, לארגן לזקיקים ולהתמיין לthyrocytes ו-C-תאים, תלוי במוצא שלהם. תאי האנדותל המופיעים ברקמות microdissected גם להתרבות ולפלוש לאונות בלוטת התריס סוף סוף לקשר הדוק עם מבנה זקיקי אפיתל, ללא תלות בזרימת דם או גורמים במחזור. כמו פיתוח של explants בנאמנות משחזר in vivo לפתחment, מערכת זו התרבות היא אופטימלי ללמוד morphogenetic ואירועי בידול המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס.
ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון, ומערכת התרבות ניתנת להורדה ובניסויי רווח של הפונקציה. לבסוף, הזמן לשגות הדמיה של explants בלוטת התריס שכותרתו fluorescently על צלחות פלסטיק מיקרוסקופית ניתן לנצל כדי לחקור טוב יותר קינטיקה והמשכיות של תנועות morphogenetic המתרחשות בגוף חי. זמן לשגות הדמיה כבר נעשתה שימוש כדי ללמוד המורפוגנזה הסתעפות של הלבלב 15,16 או ניצן ureteric 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח, culturing explants בלוטת התריס (E12.5) או אונות (E14.5) על מנת ללמוד ולהבין טוב יותר את האירועים המורכבים שמוביל להיווצרות של בלוטת התריס. בשל המוצא הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני הגופים ultimobranchial לרוחב), והגודל הקטן שלהם, שבר של מקורי מקומי רקמת E…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
Referenzen
- Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengelé, B., Many, M. -. C., Gérard, A. -. C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -. C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -. C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
