Een<em> Ex vivo</em> Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

Summary

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Abstract

De schildklier is een endocriene klier bilobated gelokaliseerd aan de basis van de hals, waardoor de schildklierhormonen T3, T4 en calcitonine. T3 en T4 worden geproduceerd door gedifferentieerde thyrocytes georganiseerd in gesloten gebieden genoemd follikels, terwijl calcitonine wordt gesynthetiseerd door C-cellen afgewisseld tussen de follikels en een dicht netwerk van bloedvaten. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn uitvoerig beschreven en bestudeerd, de vorming van de "angio-folliculaire" eenheden, de verdeling van C-cellen in het parenchym en paracriene communicatie tussen epitheel-en endotheelcellen is verre van duidelijk.

Deze methode beschrijft de opeenvolgende stappen van muis embryonale schildklier anlagen dissectie en haar cultuur op semiporous filters of op microscopie plastic dia's. Binnen een periode van vier dagen, deze cultuur systeem trouw recapituleert in vivo schildklier ontwikkeling. Namelijk (i) bilobation van het orgel plaatsvindt (bij E12.5 explantaten), (ii) thyrocytes voorlopers ordenen in follikels en polariseert, (III) thyrocytes en C-cellen differentiëren, en (iv) endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel prolifereren, migreren in de schildklier lobben, en nauw te betrekken bij de epitheelcellen, zoals ze doen in vivo.

Schildklier weefsel kan worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo's. Bovendien explantaten cultuur kan worden gemanipuleerd door toevoeging van inhibitoren, blokkerende antilichamen, groeifactoren, of cellen of geconditioneerd medium. Ex vivo ontwikkeling kan in real time worden geanalyseerd, of op elk moment van de cultuur door immunokleuring en RT-qPCR.

Tot slot, de schildklier explantaatkweek gecombineerd met downstream hele-mount of op de afdelingen beeldvorming en profilering van genexpressie biedt een krachtig systeem voor het manipuleren en bestuderen van morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen van de schildklier organogenesis.

Introduction

De schildklier is een verzameling van onafhankelijke epitheliale bolletjes, de zogenaamde follikels, omgeven door een dicht netwerk van endotheel haarvaten. Deze organisatie maakt schildklierfunctie: endotheliale capillairen voorzien thyrocytes met jodium, vereist voor T3 en T4 hormoonsynthese en deze laatste op het hele lichaam verspreiden. Verspreid tussen de follikels en haarvaten, C-cellen produceren het hormoon calcitonine hypocalcemieperioden ^1. Hoewel volwassen schildklier architectuur en functies zijn bekend, de cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de schildklier embryonale ontwikkeling (follikel vorming en differentiatie) zijn verre van begrepen.

Tijdens de embryogenese, thyrocytes voorlopercellen afkomstig is als een verdikking (de middellijn anlage) van de ventrale wand van de voordarm endoderm op embryonale dag (e) 8.5 in de muis embryo, terwijl de C-cellen voorlopercellen ontstaan ​​bij E11.5 als druppel-vormige uitsteeksels ( de ultimobranchial bodies) van het vierde faryngeale zakjes ^2-6. De middellijn knop los dan van het endoderm, breidt bilateraal fuseren op E13.5 de ultimobranchial organen aan elke kant van de luchtpijp. Tenslotte thyrocytes organiseren in follikels en C-cellen differentiëren.

Huidige kennis over schildklier vorming komt vooral van histologische analyse van vaste weefsels, maar de morfogenetische gebeurtenissen betrokken bij de vorming van de schildklier zijn zeer dynamisch en communicatie en interacties tussen verschillende celtypen en met de extracellulaire matrix te betrekken. Recent onderzoek toonde aan dat thyrocyte voorlopers van hoge niveaus van VEGF in endotheelcellen de ontwikkeling schildklier, en, beurtelings, gerekruteerd endotheelcellen bevorderen follikel vorming en C-cellen differentiatie ^7.

De meeste ex vivo studies over de schildklier zijn uitgevoerd op geïsoleerde volwassen schildklier-afgeleide cellen, geteeld op 2D weefselkweek plastic dishes of in 3D matrices. Gebruik van dit soort culturen, gedifferentieerde folliculaire cellen ofwel blijven gepolariseerd en georganiseerd als follikels of opnieuw op te pakken van een 3D-organisatie ^8-10. Echter, deze zuivere epitheelcellen, geëxplanteerd van de fysiologische omgeving, en gekweekt in 2D, negeren interacties met de extracellulaire matrix, cytokinen, groeifactoren en andere celtypes zoals endotheliale of zenuwen cellen die zij normaal tegenkomen in vivo. Een zeer mooie studie die onlangs beschreef een differentiatie protocol van ES-cellen in de schildklier follikels met behulp van een laatste cultuur stap in 3D matrigel ^11. Echter, deze 3D culturen missen contact met andere celtypen.

Op basis van eerdere kennis over pancreas en speekselklieren orgelcultuur ^12-14 is een werkwijze voor het ontleden muis embryonale schildklier Anlagen en kweken van de explantaten op semiporous filters of microscopie plastic objectglaasjes ontwikkeld.

Wanneerwerken met E12.5 embryo's, de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en de twee zijdelingse ultimobranchial lichamen) opgelegd de microdissection van een groot fragment van weefsel. Dit bevatte de luchtpijp, maar niet de slokdarm en uitgebreid van de kieuwboogarteriën tot de arytenoid zwelling. Wanneer gekweekt op filters, de middellijn Anlage zich lateraal aan weerszijden van de luchtpijp, waar fuseren met de ultimobranchial lichamen de twee lobben schildklier, nog verbonden door een smalle landengte vormen.

In cultuur epitheelcellen prolifereren, organiseren in follikels en differentiëren in thyrocytes en C-cellen, afhankelijk van hun oorsprong. Endotheelcellen in de gemicrodissecteerde weefsel ook vermenigvuldigen en binnenvallen de schildklier lobben om eindelijk nauw te betrekken bij de epitheliale folliculaire structuur, onafhankelijk van de bloedstroom of circulerende factoren. Aangezien ontwikkeling van de explantaten trouw recapituleert in vivo ontwikkelingment, deze cultuur systeem optimaal te morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen tijdens schildklier ontwikkeling te bestuderen.

Schildklier weefsels kunnen worden verkregen bij wild type, knockout of fluorescerende transgene embryo's, en de cultuur systeem vatbaar is voor verlies-en winst-of-function experimenten. Ten slotte kan time-lapse imaging van fluorescent gelabelde schildklier explantaten op microscopie plastic schaaltjes worden benut om de kinetiek en de continuïteit van morfogenetische bewegingen die zich voordoen in vivo beter te onderzoeken. Time-lapse imaging is al gebruikt om vertakking morfogenese van de alvleesklier ^15,16 of de ureterknop ¹⁷ bestuderen.

Protocol

Muizen werden opgevoed en behandeld volgens de principes van proefdier verzorging van de Universiteit Animal Welfare Committee. Alle procedures en protocollen werden goedgekeurd door deze commissie. 1. Coating van Microscopie Plastic Cultuur Chambers OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De twee soorten coating functioneel gelijkwaardig. Coat plastic cultuur kamers met fibronectine een dag …

Representative Results

Schildklier anlages (middellijn en UB, samen met omliggende weefsels) en schildklier lobben ontleed uit muizenembryo's op E12.5 en e13.5/e14.5 respectievelijk (figuur 1). Na een dag in kweek op filterpapier, de middellijn Anlage zichtbaar (Figuur 2A) als langwerpig weefsel verspreid bovenop de luchtpijp. Het vormt steeds twee lobben aan weerszijden van de luchtpijp. Als geïsoleerd schildklier lobben (E13.5 of E14.5) worden gekweekt, zullen ze uitbreiden, ondergaan morfogenese en ep…

Discussion

Dit document beschrijft een werkwijze voor het ontleden en kweken schildklier explantaten (E12.5) of lobben (E14.5) teneinde te bestuderen en beter inzicht in de complexe gebeurtenissen die leiden tot de vorming schildklier. Door de dubbele oorsprong van de schildklier Anlagen (de middellijn anlage en twee laterale ultimobranchial organen), en hun geringe omvang, een fragment van E12.5 weefsel gelokaliseerd rostraal van de kieuwboogarteriën en met de luchtpijp, maar niet de slokdarm wordt gemicrodissecteerde. Zoals ge?…

Materials

µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile	proxylab	80826
Collagen Type I, rat tail	Millipore	08-115
Fibronectin from human plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Tungsten wire	Goodfellow	LS237450
culture plate insert (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261