マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
高い整合性を持つRNAの単離は、ノーザンブロット法9、定量RT-PCRの1または5の遺伝子発現プロファイリングなどの日常的な分子生物学の実験のために必要とされている。 RNA単離の最も現代的な方法は、グアニジンチオシアネートプロトコル2、3の修正に基づいている。グアニジンチオシアネートは、強力なタンパク質変性剤であり、効果的に、最も条件の下でリボヌクレアーゼの活性を破壊します。をChomczynskiおよびSacchi 3の一般的な方法は、約4時間までの単離時間を短縮する、チオシアン酸グアニジン溶解溶液にフェノールを組み合わせる。多くの市販のRNA抽出試薬をChomczynskiおよびSacchi法3に基づいている。
例えば、ヒトやマウスの膵臓リボヌクレアーゼ多い組織は、RNAを分離するための新たな課題が発生します。マウスの膵臓は、そのうちのいくつかは、ドゥリンリリースされるリボヌクレアーゼ6の75ミリグラムを含有することができるg組織の自己消化、その結果膵臓組織の破壊。グアニジンチオシアプロトコルの改変に成功し、高い完全性2、4、7、10の膵臓からRNAを単離するために使用されてきた。RNA安定化試薬の注入マウスの膵臓中へ、高い整合性4、7、10の一方注入をRNAの単離を容易に膵臓へのソリューションは素晴らしいスキルを必要とし、このような解剖顕微鏡などの特殊な機器を必要とし、処置の間に組織構造を崩壊させることは、細胞溶解の原因となります。 RNA安定化試薬を用いて組織を灌流すると、タンパク質の単離と組織染色など、他のアプリケーションに干渉することがあります。さらに、この技術は、ヒト膵臓からRNAを単離するには適していない。他のプロトコルは、研究者2による特定の溶液の調製を必要とする。
我々は、マウスの膵臓からの高い整合性RNAを単離するためのプロトコルを報告する。目Eプロトコルは、以前に発表された方法の要素を使用しており、大部分は、標準的なフェノール/グアニジンチオシアネート·ベースの溶解試薬プロトコルに基づいています。これは、専門の溶液の調製を必要とせず、また膵臓に試薬の注入を必要としません。成功したRNAの単離のための重要なステップは、未消化組織の除去は、得られたRNA溶液にリボヌクレアーゼ阻害剤の分離および包含を位相の前に、組織比に高いフェノール/グアニジン系、溶解試薬を含む。これらおよび他の変更を使用して、我々は、典型的には、7より大きいルーチン遺伝子発現解析に用いるRINでRNAを単離する。
Protocol
Representative Results
Discussion
リボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを単離することは分子生物学的実験のための大きな課題を表しています。様々な試薬およびキットは、主にRNA抽出のフェノールグアニジンチオシアネート法に基づいているが市販されている。グアニジンチオシアネートは、タンパク質を変性し、このようにリボヌクレアーゼ活性を低下させる。しかし、膵臓リボヌクレアーゼの膨大な大きさは、RNA単離?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らの有益なコメント、提案やそのプロトコルの共有のため建華玲、レイモンド·マクドナルド、ガルビンスウィフト、ミシェル·グリフィン、ポールGrippoとSatyanarayana Rachaganiに感謝します。この作品は、付与U01CA111294、オハイオ州立大学学内研究プログラムからのアイデア開発賞によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Referenzen
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