Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
Se requiere Aislamiento de ARN con una alta integridad para los experimentos de biología molecular de rutina, como el norte de borrones 9, QRT-PCR 1 o perfiles de expresión genética 5. La mayoría de los métodos contemporáneos de aislamiento de ARN se basan en modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina 2, 3. Tiocianato de guanidina es un fuerte desnaturalizante de proteínas y se interrumpir efectivamente la actividad de la ribonucleasa bajo la mayoría de condiciones. El método popular de Chomczynski y Sacchi 3 combinó fenol a la solución de tiocianato de guanidina de lisis, lo que reduce el tiempo de aislamiento a aproximadamente 4 horas. Muchos reactivos de extracción de ARN comercialmente disponibles se basan en el método de Chomczynski y Sacchi 3.
Ribonucleasa tejidos ricos como humano o de ratón páncreas presenta un desafío adicional para el aislamiento de ARN. Ratón páncreas puede contener hasta 75 mg de ribonucleasa 6 algunos de los cuales se dará a conocer During interrupción del tejido pancreático que resulta en la autolisis de los tejidos. Las modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina se han utilizado con éxito para aislar ARN a partir de páncreas con alta integridad 2, 4, 7, 10. Infusión de ARN de estabilización reactivo en páncreas de ratón aislamiento facilitado de ARN con alta integridad 4, 7, 10, sin embargo infusión de soluciones en el páncreas requiere una gran habilidad, pueden requerir instrumentos especializados tales como un microscopio de disección y alterar la arquitectura del tejido durante el procedimiento puede resultar en la lisis celular. Perfusión tisular con el reactivo de estabilización de ARN podría interferir con otras aplicaciones como el aislamiento de proteínas y la tinción histológica. Además, esta técnica no es adecuada para el aislamiento de ARN a partir de páncreas humano. Otros protocolos requieren la preparación de soluciones específicas del investigador 2.
Se presenta un protocolo para aislar ARN con una alta integridad de páncreas de ratón. Thprotocolo de correo utiliza elementos de los métodos publicados anteriormente y se basa en gran parte de los protocolos de reactivo de lisis estándar de fenol / guanidina basado en tiocianato. No requiere la preparación de soluciones especializados ni requiere la infusión de los reactivos en el páncreas. Los pasos críticos para el aislamiento de ARN éxito incluyen un fenol alta / a base de guanidina lisis reactivo proporción de tejidos, extracción de tejido no digerido antes de la separación de fases y la inclusión de un inhibidor de ribonucleasa a la solución de ARN resultante. El uso de estas y otras modificaciones, que típicamente aislar el ARN con Rin mayor que 7 para ser utilizado para el análisis de la expresión génica de rutina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aislar ARN de tejidos que se ribonucleasa rico representa un gran reto para los experimentos de biología molecular. Varios reactivos y kits están disponibles en el mercado que se basan principalmente en el método de tiocianato de guanidina fenol de la extracción de RNA. Tiocianato de guanidina desnaturaliza la proteína y por lo tanto reduce la actividad de la ribonucleasa. Sin embargo, la magnitud de la ribonucleasa en el páncreas requiere modificaciones adicionales a los protocolos estándar de aislamiento de ARN…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo y Satyanarayana Rachagani por sus útiles comentarios, sugerencias y compartir sus protocolos. Este trabajo fue apoyado por U01CA111294 subvención y un premio de desarrollo de la idea del Programa de Investigación Intramural la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Referenzen
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