마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
높은 무결성 RNA의 분리는 같은 북부 블로 팅 9, QRT-PCR 1 또는 5 프로파일 유전자 발현 같은 일상적인 분자 생물학 실험이 필요합니다. RNA 분리 대부분의 현대적인 방법을 구아니딘 티오 시아 네이트 프로토콜 (2)의 변형에 기초한다 3. 구아니딘 티오 시아 네이트는 강한 단백질 변성제이고 효과적으로 대부분의 조건에서 리보 뉴 클레아 제의 활성을 방해 할 것이다. Chomczynski 및 사키 3의 인기있는 방법은 약 4 시간에 분리 시간을 줄이고, 구아니딘 티오 시아 네이트 용해 용액에 페놀을 배합. 대부분의 시판되는 RNA 추출 시약은 Chomczynski와 사키 방법 3를 기반으로하고 있습니다.
같은 인간이나 마우스의 췌장 등의 리보 뉴 클레아 풍부한 조직은 RNA를 분리하는 추가 문제를 제공합니다. 마우스의 췌장은 그 중 일부는 운영 시간에만 출시 될 예정 리보 뉴 클레아 제 6의 최대 75 밀리그램을 포함 할 수있다G 조직의자가 분해의 결과로 췌장 조직의 파괴. 구아니딘 티오 시아 네이트 프로토콜의 수정은 성공적으로 높은 무결성 2, 4, 7, 10 높은 무결성 4, 7, 10와 RNA의 마우스 췌장 용이 분리로 RNA 안정화 시약. 주입 그러나 주입으로 췌장으로부터 RNA를 분리하는 데 사용되어왔다 췌장에 솔루션은 좋은 기술을 필요로 같은 해부 현미경 및 절차를 수행하는 동안 조직 구조를 방해하는 세포 용해 될 수 있습니다와 같은 전문 장비가 필요할 수 있습니다. RNA 안정화 시약과 조직을 관류하는 단백질 분리 및 조직 학적 염색 등의 다른 응용 프로그램을 방해 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 인간의 췌장에서 RNA를 분리에는 적합하지 않다. 다른 프로토콜은 조사 (2)에 의해 특정 솔루션의 준비가 필요합니다.
우리는 마우스의 췌장에서 높은 무결성과 RNA를 분리하는 프로토콜을보고합니다. 일E 프로토콜은 이전에 발행 된 방법의 요소들을 사용하여 주로 표준 페놀 / 구아니딘 티오 시아 네이트 계 용해 시약 프로토콜에 기초한다. 이것은 특수한 용액의 제조를 필요로하지 않으며 이는 췌장에 시약의 주입을 요구한다. 성공적인 RNA 격리를위한 중요한 단계는 조직의 비율, 그 결과 RNA 용액에 분리 리보 뉴 클레아 제 억제제의 포함을 단계적으로 이전에 소화되지 않은 조직의 제거에 높은 페놀 / 구아니딘 계 용해 시약 있습니다. 이들 및 다른 변형을 사용하여, 우리는 일반적으로 12보다 큰 루틴 유전자 발현 해석에 사용하는 RIN으로 RNA를 분리.
Protocol
Representative Results
Discussion
풍부한 리보 뉴 클레아하는 조직에서 RNA를 분리하는 것은 분자 생물학 실험에 대한 큰 도전을 나타냅니다. 각종 시약 및 키트는 주로 RNA 추출의 페놀 구아니딘 티오 시아 네이트 방법에 시판을 기반으로하는 그. 구아니딘 티오 시아 네이트는 단백질을 변성 따라서 리보 뉴 클레아 제의 활성을 감소시킨다. 그러나 췌장에서 리보 뉴 클레아 제의 깎아 지른듯한 크기는 RNA 분리의 표준 프로토콜을 추…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 도움이 의견, 제안 및 자신의 프로토콜을 공유 지안 후아 링, 레이몬드 맥도날드, 갤빈 스위프트, 미셸 그리핀, 폴 Grippo 및 Satyanarayana Rachagani 감사합니다. 이 작품은 부여 U01CA111294와 오하이오 주립 대학 교내 연구 프로그램에서 아이디어 개발의 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Referenzen
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