Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
Yüksek bütünlük RNA izolasyonu örneğin kuzey blot 9, qRT-PCR 1 ve 5 gen ekspresyonu gibi rutin moleküler biyoloji deneyleri için gereklidir. RNA izolasyonu çoğu modern yöntemler, guanidin tiyosiyanat protokolleri 2, modifikasyonları dayanmaktadır 3. Guanidin tiyosiyanat güçlü protein denatüran ve etkili bir çoğu durumda ribonükleaz aktivitesini bozacak. Chomczynski ve Sacchi 3'ün yaygın kullanılan yöntem, yaklaşık 4 saat için izolasyon süresini azaltmak, guanidin tiyosiyanat lizis çözeltisine fenol birleştirildi. Pek çok ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon reaktifleri Chomczynski ve Sacchi yöntem 3 üzerine dayanır.
Bu tür insan veya fare gibi pankreas Ribonuclease zengin dokuların RNA'nın izole edilmesi için ek bir zorluktur. Fare pankreas bazıları Durin çıkacak ribonükleaz 6 kadar olan 75 mg içerebilirg doku otoliz sonuçlanan pankreas dokusunun bozulması. Guanidin tiyosiyanat protokollerin modifikasyonları başarılı bir şekilde yüksek bütünlüğü 2, 4, 7, 10, yüksek bütünlüğü 4, 7, 10, RNA fare pankreası kolaylaştırılmış izolasyon içine RNA stabilizasyonu reajanı. Infusion Ancak infüzyon of ile pankreasından RNA'yı izole etmek için kullanılmıştır pankreas içine çözümler, büyük bir beceri gerektirir böyle bir mikroskop ve işlem sırasında doku mimarisini bozan hücre parçalama neden olabilir gibi özel araçlar gerekebilir. RNA stabilizasyon reaktif ile dokuyu perfüze protein izolasyonu ve histolojik boyama gibi diğer uygulamaları ile etkileyebilir. Ayrıca, bu teknik, insan pankreasından RNA'nın izole edilmesi için uygun değildir. Diğer protokoller 2 araştırmacı tarafından özel çözümler hazırlanmasını gerektirir.
Biz fare pankreas yüksek bütünlük RNA izole etmek için bir protokol rapor. The protokolü daha önce yayınlanmış yöntemlerden elemanları içeren ve büyük ölçüde standart fenol / guanidin tiyosiyanat tabanlı liziz reaktif protokoller üzerine dayanır. Bu, özel bir çözeltilerin hazırlanmasını gerekli değildir, ne de pankreas içine reaktiflerin infüzyon gerektirir. Başarılı bir RNA izolasyonu için kritik adım doku oranı, elde edilen RNA çözeltiye ayırma ve bir ribonükleaz inhibitörü dahil faz önce sindirilmemiş doku çıkarılması için yüksek bir fenol / guanidin bazlı liziz reaktif içerir. Bu ve diğer değişiklikler kullanarak, tipik olarak daha büyük 7 rutin gen ekspresyon analizi için kullanılacak RIN ile RNA izole eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zengin ribonükleaza olan dokulardan RNA izole moleküler biyoloji deneyleri için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Çeşitli belirteçler, ve kitler öncelikle RNA ekstraksiyon fenol guanidin tiyosiyanat yöntemine bağlı ticari olarak temin dayanır ki. Guanidin tiyosiyanat protein denatüre ve böylece ribonükleaz etkinliğini azaltır. Ancak, pankreas ribonükleaz çokluğu bir RNA izolasyonu standart protokollere ek değişiklikler gerektirir. Standart bir protokol guanidin tiyosiyanat yöntemine göre oldu?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların yararlı yorum, öneri ve protokol paylaşımı için Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul GRIPPO ve Satyanarayana Rachagani teşekkür ederim. Bu çalışma hibe U01CA111294 ve Ohio State Üniversitesi İntramural Araştırma Programı'ndan bir Fikir Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Referenzen
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemie. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. . RNA A Laboratory Manual. , (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
