Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
De cellen worden onderworpen aan mechanische belasting in veel weefsels, en deze mechanische stimulatie is aangetoond dat veranderingen in de patronen van genexpressie, afgifte van groeifactoren, cytokinen, of verbouwen van de extracellulaire matrix te bevorderen cytoskelet 1-4. De intracellulaire signalen getransduceerd door deze mechanische stimuli optreden door het proces van mechanotransductie 5-7. In het ademhalingssysteem, vloeit uit mechanotransduction de toename van reactieve zuurstof species (ROS) 8,9 en pro-inflammatoire cytokinen 10 in pulmonaire epitheelcellen in aanwezigheid van cyclische trekbelasting. Sterk bewijs suggereert ook dat overmatige trekbelasting leidt tot directe schade aan het alveolaire epitheel, naast de biochemische reacties van cellen 11-14. Hoewel de nadruk ligt hier vooral op de reactie van longcellen aan mechanische vervorming, paden veroorzaakt door mechanotransductie spelen een belangrijke rol in de basic functie van vele weefsels in het menselijk lichaam, waaronder de regulering van de vasculaire tonus en de 15 ontwikkeling van de groeiplaat 16.
De toenemende belangstelling mechanotransduction heeft geleid tot de ontwikkeling van talrijke inrichtingen voor de toepassing van fysiologisch relevante mechanische belastingen op gekweekte cellen en weefsels. Met name inrichtingen aanbrengen van een trekspanning, die een gebruikelijke vorm van mechanische belasting ervaren door weefsel, populair 11,17-19. Veel van de beschikbare inrichtingen zijn ofwel uitgevoerd als een bioreactor voor weefselregeneratie toepassingen of niet bevorderlijk real time imaging met stretch. Als zodanig is er behoefte aan middelen en methoden om cellen en weefsels kunnen visualiseren spanning het onderzoek trajecten van mechanotransduction vergemakkelijken.
Hierin werd een in-plane mechanische spaninrichting ontworpen en protocollen werden ontwikkeld om m passenultiple vormen van stam aan weefsels en cellen terwijl beeldvorming van de biochemische en mechanische reacties in real time (Figuur 1A-D). De inrichting maakt gebruik van zes regelmatig verdeelde klemmen omtrek aangebracht op een flexibel membraan begrijpen en toepassen van een in-vlak radiale uitzetting tot ongeveer 20% (Figuur 1B). De bedieningsinrichting kan in een celkweek incubator geplaatst gedurende een langere tijd, terwijl de motor (figuur 1C) gepositioneerd buiten de incubator en gecontroleerd door proprietaire software die door de motor leverancier. De motor is verbonden met een lineaire driver, die een interne nok roteert, drijven de zes stretcher klemmen gelijkmatig in spanning en ontspanning.
Naast de mechanische inrichting zijn aangepast flexibele membranen gemaakt van commercieel verkrijgbare celkweek bereid membranen voor gebruik in het mechanische systeem. Dan cirkelvormige wanden (met een diameter van ongeveer28 mm) werden gemaakt en vastgemaakt aan het flexibele membraan zodat cellen kunnen worden gekweekt alleen in dit gebied goed beschreven soort profiel. Om te bepalen of de positie van deze membranen in de aandrijfinrichting uniform en isotroop rek zou voorzien in het midden van het flexibele membraan, werd eindige elementen analyse uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare software (Figuur 1E-F). Het flexibele membraan werd gemodelleerd met symmetrische randvoorwaarden en gebruik van alle vierhoekige elementen van de maas. De concentrische ringen gezien in de contourgrafiek van maximum hoofdrek figuur 1F geven de isotrope verdeling van de spanning.
De rek ervaren door het membraan werd gemeten door beelden markeringen doorladen (figuur 2). Figuur 2D laat zien dat de gemiddelde membraan rek gemeten in radiale en axiale richting ongeveer lineairmet betrekking tot de toegepaste motor telt maximaal lineaire rek van 20%. Er was geen significant verschil tussen de rekniveaus gemeten tijdens uitzetting vergeleken met die gemeten tijdens het terugtrekken terug naar de rustpositie. Vervolgens wordt de verplaatsing van humane bronchiale epitheelcellen (16HBE) en hun kernen gekweekt op de aangepaste flexibel membraan werden gemeten. Fluorescent gelabelde (DAPI) kernen van de 16HBE cellen werden afgebeeld met behulp van een 20X objectief onder een confocale microscoop, terwijl hele cel verplaatsing werd gemeten met fase contrast beelden die zijn opgenomen met een digitale microscoop. Zoals blijkt uit figuur 3, de spanning gemeten door verplaatsing van kernen was vergelijkbaar met die gemeten door verplaatsing van markeringen op het membraan, tot ~ 20% lineair rek. Dit bevestigt dat de spanning uitgeoefend op de membranen van de hechtende cellen werd overgebracht. De protocollen die het gebruik van de aangepaste inrichting op een traditionele microscoop en een atomic force microscope worden in de volgende stappen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een uniek apparaat voor live-cell imaging tijdens mechanische stretch is ontwikkeld; en dit apparaat werd gebruikt in een protocol om long epitheelcellen Mechanobiology bestuderen. In voorlopige studies werd gevonden dat een enkele plaats rek stimuleerde de productie van mitochondriale superoxide in bronchiale epitheelcellen. Bovendien werd aangetoond dat verhoogde mechanische belasting veroorzaakt directe schade aan de integriteit van een monolaag van alveolaire epitheelcellen.
Om deze voor…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag dat Fedex Instituut voor Technologie van de Universiteit van Memphis bedanken voor hun steun. De auteurs willen graag aan studenten van de senior ontwerp projectgroep in het Mechanical Engineering Department te erkennen aan de Universiteit van Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn van de afdeling Universiteit van Memphis CTW voor motorbesturing en Dr. Bin Teng en mevrouw Charlean Luellen voor hun hulp in celcultuur. Dit werk werd ondersteund door K01 HL120912 (ER) en R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
Referenzen
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
