Imaging Live Cell durante meccanica Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Le cellule sono sottoposte a sollecitazioni meccaniche in molti tessuti, e questa stimolazione meccanica ha dimostrato di promuovere cambiamenti nei modelli di espressione genica, il rilascio di fattori di crescita, citochine, o rimodellamento della matrice extracellulare e citoscheletro 1-4. I segnali intracellulari trasdotte da tali stimoli meccanici avvengono attraverso il processo di meccanotrasduzione 5-7. Nel sistema respiratorio, un risultato di mechanotransduction è l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) 8,9 e citochine pro-infiammatorie 10 in cellule epiteliali polmonari in presenza di deformazione a trazione ciclica. Forte evidenza suggerisce anche che un'eccessiva deformazione a trazione porta a dirigere ferita all'epitelio alveolare, oltre alle risposte biochimiche delle cellule 11-14. Anche se il fuoco qui è soprattutto sulla risposta delle cellule polmonari a deformazione meccanica, percorsi indotte da meccanotrasduzione svolgono un ruolo chiave nei basic funzione di molti tessuti del corpo umano, compresa la regolazione del tono vascolare 15 e lo sviluppo della piastra di crescita 16.
Il crescente interesse meccanotrasduzione ha portato allo sviluppo di numerosi dispositivi per l'applicazione di fisiologicamente rilevanti sollecitazioni meccaniche alle cellule in coltura e tessuti. In particolare, i dispositivi che applicano lo sforzo a trazione, che è una forma comune di carico meccanico sperimentato da tessuto, sono popolari 11,17-19. Tuttavia, molti dei dispositivi disponibili sono sia concepita come un bioreattore per applicazioni di ingegneria tissutale o non sono favorevoli a delle immagini in tempo reale con la stirata. In quanto tale, vi è la necessità di sviluppare strumenti e metodi in grado di visualizzare le cellule e tessuti in tensione per facilitare la ricerca di percorsi di meccanotrasduzione.
Qui, un dispositivo che si estende in piano meccanico è stato progettato e sono stati sviluppati protocolli per applicare mforme ultiple di tensione ai tessuti e cellule pur consentendo l'imaging delle risposte biochimiche e meccaniche in tempo reale (Figura 1A-D). Il dispositivo utilizza sei morsetti equidistanti disposte circonferenzialmente ad afferrare una membrana flessibile e applicare una in piano, radiale distensione fino a circa il 20% (Figura 1B). Il dispositivo di azionamento può essere collocato in un incubatore di coltura cellulare per un periodo di tempo prolungato, mentre il motore (Figura 1C) è posizionato all'esterno dell'incubatrice e controllato da software proprietario fornito dal fornitore del motore. Il motore è collegato ad un driver lineare, che fa ruotare una camma interna, guidando i sei morsetti barella uniformemente in tensione e rilassamento.
Oltre al dispositivo meccanico, membrane flessibili personalizzati sono stati creati da commercialmente disponibili coltura cellulare membrane pronti per essere utilizzati nel sistema meccanico. Poi pareti circolari (con un diametro di circa28 mm) sono state fatte e attaccato alla membrana flessibile in modo che le cellule possono essere coltivate solo in questa regione del profilo ceppo ben descritto. Al fine di determinare se il posizionamento di queste membrane all'interno del dispositivo di azionamento fornirebbe una sollecitazione uniforme e isotropo nel centro della membrana flessibile, analisi agli elementi finiti è stata condotta utilizzando software disponibile in commercio (Figura 1E-F). La membrana flessibile è stato modellato con condizioni al contorno simmetriche e utilizzando tutti gli elementi quadrangolari per la maglia. Gli anelli concentrici visto nella trama di contorno di massima deformazione principale mostrato nella Figura 1F indicano la distribuzione isotropa del ceppo.
Il ceppo sperimentato dalla membrana è stata misurata registrando immagini marcature attraverso carico (Figura 2). Figura 2D mostra che la deformazione media membrana misurata in direzioni radiali e assiali era approssimativamente linearerispetto al motore applicata conta fino a un ceppo lineare massima di 20%. Non c'era alcuna differenza significativa tra i livelli di deformazione misurati durante distensione rispetto a quelli misurati durante la retrazione nella posizione di riposo. Successivamente, lo spostamento di cellule umane bronchiali epiteliali (16HBE) e loro nuclei coltivate sulla membrana flessibile personalizzato sono stati misurati. Fluorescente (DAPI) nuclei delle cellule 16HBE sono stati ripresi utilizzando un obiettivo 20X al microscopio confocale, mentre lo spostamento a cellula intera è stata misurata con le immagini registrate contrasto di fase con un microscopio digitale. Come si vede in figura 3, la deformazione misurato dallo spostamento dei nuclei era simile a quello misurato per spostamento di marcature sulla membrana, fino a ~ 20% di deformazione lineare. Ciò conferma che il ceppo applicato alle membrane è stata trasmessa alle cellule aderenti. I protocolli che descrivono l'uso del dispositivo personalizzato su un microscopio tradizionale e una forza microscop atomicae sono previste nei seguenti passi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo unico per l'imaging cellulare dal vivo durante allungamento meccanico è stato sviluppato; e questo dispositivo è stato utilizzato in un protocollo per studiare epiteliali polmonari mechanobiology cellule. In studi preliminari, si è constatato che un singolo tratto tenuta stimolato la produzione di superossido mitocondriale nelle cellule epiteliali bronchiali. Inoltre, è stato dimostrato che un aumento dei livelli di sollecitazioni meccaniche causate danno diretto per l'integrità di un monostr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare che Fedex Institute of Technology presso l'Università di Memphis per il loro sostegno. Gli autori desiderano ringraziare gli studenti del gruppo di progetto di design di alto livello presso il Dipartimento di Ingegneria Meccanica presso l'Università di Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn del dipartimento Università di Memphis Engineering Technology per il controllo motore , e il dottor Bin Teng e la signora Charlean Luellen per il loro aiuto in coltura cellulare. Questo lavoro è stato sostenuto da K01 HL120912 (ER) e R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
Referenzen
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
