기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
세포는 여러 조직에서의 기계적 하중을 실시하고,이 기계적 자극 유전자 발현, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 세포 외 기질의 재 형성의 방출 패턴의 변화를 촉진하고 세포 골격 1-4 밝혀졌다. 기계적 자극에서 형질 세포 내 신호는 mechanotransduction 5-7의 과정을 통해 발생한다. 호흡계에서, mechanotransduction의 일 결과는, 반응성 산소 종 (ROS) 환상 인장 변형의 존재 폐 상피 세포에서 8,9 및 전 염증성 사이토 카인 (10)의 증가이다. 강력한 증거는 과도한 인장력이 11-14 세포의 생화학 적 반응에 더하여, 폐포 상피 부상을 직접 유도 것을 시사한다. 포커스 여기서 기계적 변형에 폐 세포의 반응에 주로이지만 mechanotransduction 의해 유도 경로는 BAS에 중요한 역할혈관 음 (15)의 조정 · 성장판 (16)의 개발을 포함하여 인체의 여러 조직의 IC 기능.
mechanotransduction에 대한 관심이 증가 배양 세포 및 조직 생리 학적으로 중요한 기계적 하중의인가에 대한 여러 장치의 발전을 가져왔다. 특히, 조직 경험 기계적 하중의 일반적인 형태 인 인장 변형을, 적용 장치 11,17-19 인기 있습니다. 그러나, 사용 가능한 장치의 대부분은 어느 조직 공학 응용 프로그램을위한 생물 반응기로 설계 또는 스트레칭 실시간 영상에 도움이 아니다. 이와 같이, mechanotransduction의 경로의 조사를 용이하게하기 위해 장력 세포와 조직을 시각화 도구와 방법의 개발이 요구된다.
여기서, 면내 기계적 연신 장치를 설계하고, 프로토콜은 m을 적용하기 위해 개발되었다ultiple 조직에 변형의 형태와 세포를 실시간으로 (그림 1A-D)의 생화학 적 및 기계적 응답의 영상을 허용하면서. 장치는가요 성 멤브레인을 잡고 약 20 % (도 1b)에 면내 방사형 팽창 위로 적용 원주 등 간격 배치 여섯 클램프를 사용한다. 모터 (도 1C)는 인큐베이터의 외측에 배치 된 모터 공급자 독점 소프트웨어에 의해 제어되는 동안 구동 장치는 장기간 세포 배양 용 인큐베이터에 배치 될 수있다. 모터는 긴장과 이완 균일 여섯 들것 클램프 구동, 내부 캠을 회전 선형 드라이버에 접속된다.
기계적인 장치 이외에, 맞춤형가요 성 멤브레인은 기계 시스템에 사용되는 시판되는 세포 배양 준비 막으로부터 만들어졌다. 약의 직경 그리고 원형 벽 (28mm)를 만들어 세포 만 잘 설명 변형 프로파일이 지역에서 배양 할 수 있도록 유연한 막에 부착 하였다. 구동 장치 내에서 이러한 막의 배치는가요 성 멤브레인의 중앙에 균일하고 등방 변형을 제공 할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 유한 요소 분석은 시판되는 소프트웨어 (도 1E-F)를 수행 하였다. 플렉서블 멤브레인은 대칭 경계 조건으로 메시에 대한 모든 사변형 요소를 이용하여 모델링되었다. 그림 1 층에 표시된 최대 주 변형률의 윤곽 플롯에서 볼 동심 링은 변형의 등방성 분포를 나타냅니다.
막에 의해 경험 한 스트레인은 하중 (도 2)를 통해 표시의 화상을 기록하여 측정 하였다.도 2d는 반경 방향 및 축 방향으로 측정 된 평균 막 응력은 대략 선형임을 나타낸다적용된 모터에 대하여 20 %의 최대 선형 변형까지 카운트한다. 다시 정지 위치로 후퇴 동안 측정과 비교 팽창 동안 측정 균주 수준 사이에는 유의 한 차이가 없었다. 다음으로,가요 성 멤브레인에 정의 배양 인간 기관지 상피 세포 (16HBE) 및 그 핵의 변위를 측정 하였다. 전 세포 변위 디지털 현미경 기록 위상차 이미지를 측정 하였다 반면 16HBE 세포의 형광 표지 (DAPI) 핵은, 공 초점 현미경으로 20 배의 대물 렌즈를 사용하여 영상화되었다. 도 3에서 보듯이, 핵의 변위에 의해 측정 된 변형은 최대 ~ 20 %의 선형 변형에 막 마크의 변위에 의해 측정 된 것과 유사 하였다. 이는 멤브레인에 적용 균주 부착 세포에 전달되었음을 확인한다. 전통적인 현미경에 정의 디바이스의 사용을 기술하는 프로토콜 및 원자 힘 microscopE는 다음과 같이 제공된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기계적 스트레칭 동안 라이브 세포 이미징의 고유 장치가 개발되었다; 그리고이 장치는 폐 상피 세포 제어 공학을 연구 프로토콜에서 사용되었다. 예비 연구에서, 단일 개최 스트레칭 기관지 상피 세포에서 미토콘드리아 초과 산화물의 생산을 자극 한 것으로 나타났습니다. 또한, 기계적인 변형의 수준 증가는 폐포 상피 세포 단층의 무결성에 대한 직접적인 손상을 야기하는 것이 입증되었다. </p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 지원을 위해 멤피스 대학의 기술 페덱스 연구소 감사 그 싶습니다. 저자는 멤피스 (데이비드 버틀러, 재키 카터, 도미닉 클리블랜드, 야곱 섀퍼) 대학에서 기계 공학 부서의 수석 디자인 프로젝트 그룹의 학생들을 인정하고 싶습니다, 모터 제어를위한 대학 멤피스의 공학 기술 부서의 다니엘 콘 세포 배양에서의 도움, 박사 빈 탱과 양 Charlean Luellen. 이 작품은 K01 HL120912 (ER) 및 R01 HL123540 (CMW)에 의해 지원되었다.
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
Referenzen
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
