Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Zellen werden gegenüber mechanischen Belastungen in vielen Geweben unterzogen, und das mechanische Stimulation wurde gezeigt, dass Veränderungen in den Mustern der Genexpression, die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Umbau der extrazellulären Matrix zu fördern und Zytoskelett 1-4. Die intrazellulären Signale solcher mechanischen Reizen transduziert auftreten durch den Prozess der mechanotransduction 5-7. Im Atmungssystem ist ein Ergebnis der mechanotransduction die Erhöhung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 8,9 und proinflammatorische Zytokine 10 in Lungenepithelzellen in Gegenwart von zyklischen Zugbelastung. Starke Beweise legen auch nahe, dass die übermäßige Zugspannung führt zu Verletzungen der Alveolarepithel direkt neben den biochemischen Reaktionen der Zellen 11-14. Obwohl der Fokus liegt hier vor allem auf die Reaktion der Lungenzellen auf mechanische Verformung, Wege durch Mechanotransduktion induzierte spielen eine Schlüsselrolle in den basic Funktion vieler Gewebe im menschlichen Körper, einschließlich der Regulation des Gefäßtonus 15 und die Entwicklung der Wachstumsplatte 16.
Das wachsende Interesse an mechanotransduction hat zur Entwicklung zahlreicher Geräte für die Anwendung von physiologisch relevanten mechanischen Belastungen an kultivierte Zellen und Gewebe geführt. Insbesondere sind Geräte Anlegen einer Zugspannung, die eine häufige Form der mechanischen Belastung durch Gewebe erfahren ist, populär 11,17-19. Jedoch können viele der verfügbaren Geräte werden entweder als Bioreaktor für das Tissue Engineering-Anwendungen entwickelt oder sind nicht förderlich für eine Echtzeitabbildung mit Stretch. Als solches gibt es einen Bedarf an Werkzeugen und Verfahren, die Zellen und Gewebe unter Zugspannung zu visualisieren kann, um die Untersuchung von Wegen von mechanotransduction erleichtern.
Dabei wurde eine in der Ebene mechanischen Spannvorrichtung entwickelt und Protokolle wurden entwickelt, um m geltenultiple Formen Stamm zu Geweben und Zellen und ermöglicht die Abbildung der biochemischen und mechanischen Reaktionen in Echtzeit (1A-D). Das Gerät verfügt über sechs in Umfangsrichtung angeordnet, um eine flexible Membran greifen und gelten in der Ebene liegende radiale Ausdehnung von bis zu etwa 20% (1B) gleichmäßig beabstandete Schellen. Die Betätigungsvorrichtung kann in einem Zellkulturbrutschrank über einen längeren Zeitraum gegeben werden, während der Motor (1C) außerhalb des Inkubators angeordnet ist und von proprietärer Software vom Motorlieferanten bereitgestellt gesteuert. Der Motor ist mit einem linearen Antriebsteil, der einen Innennocken dreht, fahren die sechs Trage Klemmen einheitlich in An- und Entspannung verbunden ist.
Zusätzlich zu der mechanischen Vorrichtung wurden angepasst flexiblen Membranen aus im Handel erhältlichen Zellkultur bereit Membranen geschaffen, um in dem mechanischen System verwendet werden. Dann kreisförmigen Wände (mit einem Durchmesser von ca.28 mm) wurden hergestellt und auf die flexible Membran, so dass Zellen nur in diesem Bereich der gut beschriebene Spannungsprofil kultiviert werden, befestigt. Um zu bestimmen, ob die Position dieser Membranen innerhalb der Betätigungsvorrichtung würde gleichförmig und isotrop Belastung in der Mitte der flexiblen Membran bereitzustellen, wurde Finite-Elemente-Analyse unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software (1E-F) durchgeführt. Die flexible Membran wurde mit symmetrischen Randbedingungen und die Nutzung aller vierseitigen Elemente zu dem Netz modelliert. Die konzentrischen Ringe in der Konturdiagramm der maximalen Hauptdehnung in 1F gezeigt gesehen zeigen die isotropen Verteilung der Belastung.
Der Stamm von der Membran erfahren wurde durch die Aufnahme von Bildern von Markierungen durch Beladung (Figur 2) gemessen. 2D zeigt, dass der durchschnittliche Membran Dehnung in radialer und axialer Richtung gemessen wurde, war annähernd linearenin Bezug auf die angelegte Motor zählt bis zu einer maximalen linearen Dehnung von 20%. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Dehnungsniveaus während Ausdehnung gemessen im Vergleich mit denen beim Zurückziehen wieder in die Ruheposition gemessen wird. Als nächstes wird die Verschiebung der humanen bronchialen Epithelzellen (16HBE) und ihre Kerne auf dem benutzerdefinierten flexible Membran kultiviert wurden, wurden gemessen. Fluoreszenzmarkierten (DAPI) Kerne der 16HBE Zellen wurden mit einem 20x-Objektiv unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird, während ganze Zelle Verschiebung wurde mit Phasenkontrast-Aufnahmen mit einem digitalen Mikroskop aufgenommenen Mess. Wie in Figur 3 zu sehen ist, die Belastung durch die Verschiebung der Kerne gemessen wurde, war ähnlich der durch Verschieben von Markierungen auf der Membran gemessen wird, bis zu ca. 20% linear Belastung. Dies bestätigt, daß der Stamm zu den Membranen aufgebracht wurde zu den adhärenten Zellen übertragen. Die Protokolle, die die Verwendung des benutzerdefinierten Geräte auf einem herkömmlichen Mikroskop und ein Atomkraft microscope werden in den folgenden Schritten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein einzigartiges Gerät für Live Cell Imaging bei mechanischer Dehnung entwickelt; und diese Vorrichtung wurde in einem Protokoll zum Lungen Epithelzellen Mechanobiologie studieren. In Voruntersuchungen wurde festgestellt, dass eine einzige statt Streck stimuliert die Produktion von Superoxid in mitochondrialen bronchiale Epithelzellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erhöhte mechanische Belastung verursacht direkte Beschädigung der Integrität einer Monoschicht von alveolären Epithelzellen.
<p class="jove_…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten, dass Fedex Institute of Technology an der Universität von Memphis danken für ihre Unterstützung. Die Autoren bedanken sich bei Studenten der Senior Design-Projekt-Gruppe in der Maschinenbau-Abteilung an der Universität von Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer) anerkennen, Daniel Kohn von der Universität von Memphis Engineering Technology-Abteilung für die Motorsteuerung und Dr. Bin Teng und Frau Charlean Luellen für ihre Hilfe in der Zellkultur. Diese Arbeit wurde von K01 HL120912 (ER) und R01 HL123540 (CMW) unterstützt.
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
Referenzen
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