Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Les cellules sont soumises à des contraintes mécaniques dans de nombreux tissus, et cette stimulation mécanique a été montré pour promouvoir des changements dans les profils d'expression de gène, la libération de facteurs de croissance, des cytokines, ou le remodelage de la matrice extracellulaire et du cytosquelette 4.1. Les signaux intracellulaires transduction de ces stimuli mécaniques se produisent à travers le processus de mécanotransduction 5-7. Dans le système respiratoire, une issue de mécanotransduction est l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et 8,9 cytokines pro-inflammatoires dans 10 les cellules epitheliales pulmonaires en présence de contrainte de traction cyclique. Des preuves solides suggère également que la contrainte de tension excessive conduit à diriger un dommage à l'épithélium alvéolaire, en plus des réactions biochimiques de cellules 11-14. Bien que l'accent est mis ici principalement sur la réponse des cellules pulmonaires à la déformation mécanique, voies induites par mécanotransduction jouent un rôle clé dans les basic fonction de nombreux tissus dans le corps humain, y compris la régulation du tonus vasculaire 15 et le développement de la plaque de croissance 16.
L'intérêt croissant pour mécanotransduction a donné lieu à la mise au point de nombreux dispositifs pour l'application de contraintes mécaniques physiologiquement pertinentes à des cellules en culture et des tissus. En particulier, les dispositifs en appliquant une contrainte de traction, qui est une forme courante de chargement mécanique subi par le tissu, sont populaires 11,17-19. Cependant, de nombreux dispositifs disponibles sont soit conçu comme un bioréacteur pour les applications d'ingénierie tissulaire ou ne sont pas propices à une véritable imagerie de temps avec étirement. En tant que tel, il est nécessaire de développer des outils et des méthodes qui permettent de visualiser les cellules et les tissus en tension pour faciliter l'étude des voies de transduction mécanique.
Ici, un dispositif d'étirement mécanique dans le plan a été conçu et protocoles ont été élaborés pour appliquer multiples formes de la souche de tissus et de cellules, tout en permettant l'imagerie des réponses biochimiques et mécaniques en temps réel (figure 1A-D). Le dispositif utilise six pinces régulièrement espacées disposées circonférentiellement pour saisir une membrane flexible et d'appliquer une dans le plan, une distension radiale jusqu'à environ 20% (figure 1B). Le dispositif d'actionnement peut être placé dans un incubateur de culture cellulaire pendant une période prolongée de temps, tandis que le moteur (Figure 1C) est placée à l'extérieur de l'incubateur et contrôlé par un logiciel propriétaire fourni par le fournisseur du moteur. Le moteur est connecté à un conducteur linéaire, ce qui fait tourner une came interne, entraînant les six pinces Châssis uniformément en tension et de détente.
En plus du dispositif mécanique, les membranes flexibles personnalisés ont été créés à partir de culture disponibles dans le commerce des membranes de cellules prêtes à être utilisé dans le système mécanique. Ensuite, les parois circulaires (avec un diamètre d'environ28 mm) ont été faites sur et fixé à la membrane souple de sorte que les cellules peuvent être cultivées seulement dans cette région de bien décrit le profil de contrainte. Afin de déterminer si le placement de ces membranes dans le dispositif d'actionnement de fournir souche uniforme et isotrope dans le centre de la membrane flexible, l'analyse d'éléments finis a été réalisée en utilisant un logiciel disponible dans le commerce (figure 1E-F). La membrane flexible a été modélisée avec des conditions aux limites symétriques et en utilisant tous les éléments quadrilatères pour la maille. Les anneaux concentriques vu dans le tracé de contour de la souche maximum principal illustré à la figure 1F indiquent la distribution isotrope de la souche.
La souche subie par la membrane a été mesurée en enregistrant des images des repères à travers chargement (figure 2). La figure 2D montre que la souche de membrane moyenne mesurée dans les directions radiale et axiale est approximativement linéaireen ce qui concerne le moteur appliqué compte jusqu'à une déformation linéaire maximum de 20%. Il n'y avait aucune différence significative entre les niveaux de déformation mesurées pendant la distension par rapport à celles mesurées pendant la rétraction à la position de repos. Ensuite, le déplacement de cellules epitheliales bronchiques humaines (16HBE) et de leurs noyaux de culture sur la membrane souple sur mesure ont été mesurées. Marqué par fluorescence (DAPI) noyaux des cellules ont été imagées 16HBE en utilisant un objectif 20X sous un microscope confocal, alors que le déplacement de la cellule entière a été mesuré à l'aide des images à contraste de phase enregistrées avec un microscope numérique. Comme on le voit sur la figure 3, la déformation mesurée par déplacement des noyaux était similaire à celle mesurée par déplacement de marquage sur la membrane, jusqu'à environ 20% de déformation linéaire. Cela confirme que la contrainte appliquée aux membranes a été transmis aux cellules adhérentes. Les protocoles décrivant l'utilisation de l'appareil de mesure sur un microscope traditionnelle et un microscop à force atomiquee sont fournies dans les étapes suivantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositif unique pour l'imagerie de cellules vivantes au cours stretch mécanique a été développé; et ce dispositif a été utilisé dans un protocole d'étudier épithéliale du poumon cellule mécanobiologie. Dans des études préliminaires, on a constaté que seul un tronçon tenue stimulé la production de superoxyde mitochondriale dans les cellules épithéliales bronchiques. En outre, il a été démontré que l'augmentation des niveaux de contrainte mécanique causé des dommages directs à l&…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier que Fedex Institut de technologie de l'Université de Memphis pour leur soutien. Les auteurs tiennent à remercier les étudiants du groupe de projet de conception principal au Département de génie mécanique à l'Université de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn du département Université de Memphis Technologie du génie pour le contrôle moteur , et le Dr Bin Teng et Mme Charlean Luellen pour leur aide dans la culture cellulaire. Ce travail a été soutenu par K01 HL120912 (ER) et R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
Referenzen
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