فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
deacetylases هيستون 1 و 2 (HDAC1،2) تعريب لمواقع تكرار الحمض النووي. في الدراسة السابقة، وذلك باستخدام مثبطات انتقائية ونظام ضربة قاضية الجيني، أظهرنا وظائف جديدة لHDAC1،2 في النسخ المتماثل شوكة التقدم والاستقرار لونين الوليدة في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب الذي يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) من برومو-deoxyuridine (BrdU) DNA -labeled مع فتحة لطخة والتحليلات الغربية لقياس كميا البروتينات أو تعديل هيستون المرتبطة الحمض النووي الناشئ.
بنشاط تم علاج الخلايا المنقسمة مع HDAC1،2 مثبط انتقائي أو مع transfected الرناوات siRNAs ضد Hdac1 وHDAC2 ثم وصفت DNA تصنيعه حديثا مع bromodeoxyuridine التيميدين التناظرية (BrdU). وقد تم وضع العلامات BrdU في نقطة زمنية عندما لم يكن هناك دورة الخلية القبض كبير أو موت الخلايا المبرمج بسبب فقدان الوظائف HDAC1،2. التالي لتم تنفيذ abeling من الخلايا مع BrdU، مناعي لونين (رقاقة) من علامات أستلة هيستون أو لونين-remodeler مع الاجسام المضادة المحددة. ثم رصدت المسمى BrdU DNA المدخلات وimmunoprecipitated (أو ChIPed) DNA على غشاء باستخدام تقنية فتحة وصمة عار وثبتوا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. ثم تم تقييم كمية الحمض النووي الناشئ في كل فتحة كميا باستخدام التحليل الغربي مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. ثم تم تحديد تأثير فقدان الوظائف HDAC1،2 على مستويات تصنيعه حديثا هيستون علامات أستلة المرتبطة الحمض النووي والكروماتين remodeler عن طريق تطبيع إشارة BrdU رقاقة تم الحصول عليها من العينات المعالجة إلى عينات السيطرة.
Introduction
إصلاح الحمض النووي عيب و / أو تكرار الحمض النووي هي السبب الرئيسي لعدم الاستقرار الجينوم، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا. وحيد دون اصلاح كسر حبلا مزدوج يكفي ليسبب موت الخلايا 1. يتم تبديل المنظمة لونين عابر خلال كل تكرار وإصلاح 2،3، والفشل في الحفاظ على المعلومات جينية خلال هذه العمليات سوف يؤدي إلى تهديد للسلامة الجينوم. فقدان HDAC3 أو وظيفة HDAC1،2 يعوق التقدم S-المرحلة، والنسخ وإصلاح الحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد السمية (تلف DNA) وموت الخلايا 4-9. وبالتالي فإنه من استراتيجية عملية لاستخدام مثبطات انتقائية HDAC لتعطيل النسخ المتماثل إصلاح والكروماتين في الخلايا السرطانية وتسبب التلف في الحمض النووي، والتي بدورها يمكن أن يوقف النمو ولحث على موت الخلايا بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية سريعة النمو.
خلال تكرار الحمض النووي، وتفكيكها لونين بسرعة ومن ثم تجميعها بعد تكرار الحمض النووي. سي حديثاوالأسيتيل nthesized هيستون H4 في K5 والمخلفات K12 (H4K5K12ac) وترسب التالية على لونين، وdeacetylated أنها بسرعة عن طريق deacetylases هيستون (HDACs) 10،11. يمكن فشل الخلايا للحفاظ على لونين سلامة الوليدة التي كتبها هيستون deacetylation يؤدي إلى انهيار شوكة، وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا. أظهرنا مؤخرا أن تثبيط انتقائي من HDAC1،2 يزيد هيستون أستلة (H4K5ac، H4K12ac وH4K16ac) ويمنع SMARCA5 النشاط لونين remodeler على لونين الناشئ، الذي يرتبط مع انخفاض تطور تكرار مفترق الطرق، وزيادة انهيار شوكة وزيادة تكرار التوتر الناجم عن الحمض النووي من التلف 6 . وبالتالي، يمكن HDAC العلاج المانع يغير هيكل لونين الناشئ لتحريك الحمض النووي من التلف والموت بسرعة كبيرة في خلايا السرطان، حيث أن هذه الخلايا دورة بسرعة وتمرير عدة مرات خلال المرحلة S. ولذلك فمن المهم أن نفهم كيف تعمل HDACs لتنظيم أستلة هيستون والبروتين بيندينانوغرام للحفاظ على تكرار الحمض النووي في خلايا الثدييات.
لقياس كمي لمقدار أستلة هيستون وSMARCA5 remodeler ونين المرتبطة الحمض النووي الناشئ خلال تكرار الحمض النووي، ونحن وضعت دعا مقايسة الشذرة تعديل أسلوب BrdU رقاقة فتحة للغرب. بعد مناعي لونين (رقاقة) من المطلوب البروتين أو هيستون تعديل، وكمية من الحمض النووي الناشئ (المسمى باستخدام التناظرية ثيميدين، BrdU) في العينة رقاقة يمكن الكشف عنها باستخدام التحليل الغربي من المسمى BrdU الشذرة DNA نقل على غشاء باستخدام فتحة جهاز لطخة. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن H4K16ac (علامة تشارك في التعبئة والتغليف لونين) وأفراد الأسرة ISWI SMARCA5 (المتعلقة SNF-SWI / المصاحب المصفوفة التي تعتمد على الأكتين منظم من لونين) remodeler ونين ترتبط مع الحمض النووي الناشئ في خلايا S-المرحلة 6. وجدنا أيضا أن العلامة H4K16ac الوليدة وdeacetylated التي كتبها HDAC1،2 خلال تكرار الحمض النووي (6). يمنع H4K16acالنشاط remodeler لونين من أفراد الأسرة ISWI SMARCA5 12. وبالتالي، وذلك باستخدام تقنية BrdU-CHIP فتحة للغرب، فإننا لا يمكن ربط وظائف لHDAC1،2 في تنظيم الكروماتين إعادة عرض خلال تكرار الحمض النووي. وبالتالي، فإن تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب وصمة عار هو طريقة فعالة لقياس كمي لتكوين الجمعيات والتفكك ديناميات البروتينات أو تعديلات في مرحلة ما بعد متعدية التي لا بد أن الحمض النووي الناشئ.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها في هذه المخطوطة هي طريقة سريعة نسبيا لإثبات وجود البروتينات أو أشكالها المعدلة بعد translationally على DNA تكرارها حديثا أو الناشئ. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه التقنية واحدة لقياس حركية جمعية-تفكك البروتين أو شكله المعدل مع الحمض النووي الناشئ. هذه التقنية هي مك…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل في هذه المخطوطة من أموال من قسم علاج الأورام بالإشعاع ومعهد هانتسمان للسرطان والمعهد الوطني للصحة منح (R01-CA188520) لSB. أشكر دانييل جونسون وستيفن بينيت في مختبري ليدل على البروتوكول وشرح فوائدها. وأنا ممتن للدكتور ماهيش شاندراسيخاران (معهد هانتسمان للسرطان) للتعليق الحرجة على المخطوطة.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Referenzen
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., & Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. 2010 (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., & Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S. et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., & Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S. et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S. et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P. et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., & Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
- Alabert, C., & Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
- Clapier, C. R., & Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M. et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
