בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
deacetylases היסטון 1 ו -2 (HDAC1,2) בתרגום לאתרים של שכפול הדנ"א. במחקר הקודם, באמצעות מערכת מציאה גנטית מעכב וסלקטיבי, הראינו פונקציות חדשניות לHDAC1,2 בהתקדמות מזלג שכפול ותחזוקת הכרומטין המתהווה בתאי יונקים. בנוסף, השתמשנו בטכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי המשלבת immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של bromo-deoxyuridine DNA -labeled (BrdU) עם כתם חריץ ומערבי מנתחת למדוד כמותית חלבונים או שינוי היסטון קשור עם DNA המתהווה.
פעיל טופלו תאי החלוקה עם מעכב סלקטיבי HDAC1,2 או transfected עם siRNAs נגד Hdac1 וHdac2 ולאחר מכן DNA מסונתז חדש תויג עם bromodeoxyuridine האנלוגי תימידין (BrdU). תיוג BrdU נעשה בנקודת זמן שבו לא הייתה עצירת מחזור התא משמעותית או אפופטוזיס עקב האובדן של פונקציות HDAC1,2. l הבאabeling של תאים עם BrdU, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של סימני acetylation היסטון או הכרומטין-remodeler בוצע עם נוגדנים ספציפיים. ה- DNA הקלט שכותרת BrdU וimmunoprecipitated (או ChIPed) DNA אז הבחינו על קרום באמצעות טכניקת כתם חריץ ומשותק באמצעות UV. כמות ה- DNA המתהווה בכל חריץ אז כמותית הוערכה באמצעות ניתוח מערבי עם נוגדן אנטי BrdU. ההשפעה של אובדן של פונקציות HDAC1,2 ברמות של סימנים מסונתזים חדש הקשורים DNA היסטון acetylation וremodeler הכרומטין הייתה אז נקבעה על ידי נרמול אות BrdU-השבב המתקבלת מהדגימות שטופלו על דגימות השליטה.
Introduction
תיקון דנ"א פגום ו / או שכפול ה- DNA הוא אחד גורמים עיקריים לחוסר יציבות הגנום, שיכול לגרום למוות של תאים. הפסקת גדיל בודדת מתוקנת כפולה מספיקה כדי לגרום לתא מוות 1. ארגון הכרומטין משתנה זמני במהלך שני השכפול ולתקן 2,3, ואי-שמירה על מידע אפיגנטיים בתהליכים אלה יביאו לאיום על שלמות הגנום. אובדן HDAC3 או פונקצית HDAC1,2 מעכב התקדמות S-שלב, שכפול הדנ"א ותיקון מוביל ללחץ genotoxic (נזק לדנ"א) ותא מות 4-9. לכן אסטרטגיה מעשית לשימוש במעכבי HDAC סלקטיבית לשבש שכפול, תיקון והכרומטין בתאי סרטן ולגרום נזק לדנ"א, אשר בתורו יכול לעצור את הצמיחה ולגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי הסרטן גדלו במהירות.
במהלך שכפול הדנ"א, הכרומטין הוא מפורק במהירות ולאחר מכן מחדש הבא שכפול ה- DNA. חדש סאיH4 היסטון nthesized הוא acetylated בK5 ושאריות K12 (H4K5K12ac) והתצהיר הבא על הכרומטין, הם deacetylated במהירות על ידי deacetylases היסטון (HDACs) 10,11. כישלון של תאים כדי לשמור על שלמות הכרומטין המתהווה ידי deacetylation היסטון יכול להוביל לקריסת מזלג, אשר בתורו יכול לגרום לניזק לדנ"א ומוות של תאים. לאחרונה הראה כי עיכוב סלקטיבי של HDAC1,2 מגביר acetylation היסטון (H4K5ac, H4K12ac וH4K16ac) ומעכב את פעילות remodeler הכרומטין SMARCA5 על הכרומטין המתהווה, שבקורלציה עם התקדמות מזלג שכפול מופחתת, הגדילו את קריסת מזלג והגדילו את הנזק לדנ"א מתח מושרה שכפול 6 . לפיכך, טיפול מעכב HDAC יכול לשנות את מבנה הכרומטין המתהווה כדי לעורר נזק לדנ"א ומוות מהר מאוד בתאי סרטן, כמו מחזור תאים אלה במהירות ועובר פעמים רבות דרך S-השלב. לכן חשוב להבין כיצד HDACs לתפקד להסדיר acetylation היסטון ובינדי החלבוןng לשמור שכפול ה- DNA בתאי יונקים.
כמותית למדוד את כמות acetylation היסטון וremodeler הכרומטין SMARCA5 קשורה עם DNA המתהווה בעת שכפול ה- DNA, שהמצאנו assay שבב שונה נקרא טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבית. בעקבות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של שינוי חלבון או היסטון רצוי, כמות ה- DNA המתהווה (שכותרתו באמצעות אנלוגי תימידין, BrdU) במדגם השבב ניתן לאתר באמצעות ניתוח מערבי של שכותרת BrdU השבב ה- DNA מועבר על גבי קרום באמצעות חריץ מנגנון כתם. שימוש בטכניקה זו, הראינו כי בן משפחת ISWI SMARCA5 (רגולטור אקטין תלויה הקשורים מטריצה הקשורות SNF SWI / של הכרומטין) remodeler הכרומטין H4K16ac (סימן המעורב באריזת הכרומטין) וקשורים עם ה- DNA בתאים המתהווה S-שלב 6. מצאנו גם כי סימן H4K16ac המתהווה הוא deacetylated ידי HDAC1,2 במהלך שכפול הדנ"א 6. מעכב H4K16acפעילות remodeler הכרומטין בן משפחת ISWI 12 SMARCA5 של. לפיכך, שימוש בטכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי, אנחנו יכולים לחבר את הפונקציות לHDAC1,2 בויסות שיפוץ הכרומטין בעת שכפול ה- DNA. לפיכך, טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי הכתם היא גישה רבת עוצמה למדידת כמותית דינמיקת העמותה וניתוק של חלבונים או לאחר translational שינוייהם שקשורים ל- DNA המתהווה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא שיטה מהירה יחסית להפגין הנוכחות של חלבונים או הצורות שונה לאחר translationally על DNA משוכפל או המתהווה חדשים. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת לאדם למדוד את קינטיקה עמותה-הניתוק של חלבון או צורה שונה שלה עם ה- DNA המתהווה. טכניקה זו היא משלימה את טכנולו?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה בכתב יד זה נתמכה על ידי כספים מחוג לאונקולוגיה הקרינה וצייד מכון הסרטן והמכון הלאומי לבריאות מענק (R01-CA188520) לSB. אני מודה דניאל ג'ונסון וסטיבן בנט במעבדה שלי עבור הוכחה בפרוטוקול ומסביר את היתרונות שלה. אני אסיר תודה לד"ר מאהש Chandrasekharan (צייד מכון הסרטן) להערות ביקורתיות על כתב היד.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Referenzen
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., & Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. 2010 (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., & Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S. et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., & Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S. et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S. et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P. et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., & Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
- Alabert, C., & Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
- Clapier, C. R., & Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M. et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
